KSHV RTA上调宿主细胞Bcl-2表达的分子机制研究

高建明 Erle S.Robertson

1.三峡大学医学院病理生理学教研室，湖北宜昌 443002；2.美国宾夕法尼亚大学医学院微生物学教研室，宾夕法尼亚费城 19104

卡波氏肉瘤病毒（Kaposis'sSarcoma-AssociatedHerpesvirus，KSHV）发现于1994年，又称γ-疱疹病毒8型。该病毒是卡波氏肉瘤（Kaposis's Sarcoma）、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoa，PEL）、多中心卡氏病（multicentric Castleman's diease）的病原体[1]。KSHV病毒基因组呈双链DNA，有两种不同的生活周期：潜伏性感染（lantent infection）与裂解性复制（lytic replication）。这两种感染方式存在反馈性调节并可以相互转化[2-3]。在潜伏性感染时，病毒以游离体的形式存在，只表达 ORF73、K12、ORF72、ORF71、K15 等少数潜伏性基因，有利于建立持久性的感染[4]。在缺氧或TPA诱导等因素作用下病毒呈裂解性感染，以级联反应的形式激活一系列病毒编码基因，并导致宿主细胞的死亡及病毒子的释放，传播至新的宿主细胞[5-6]。

KSHV复制转录激活因子（replication and transcription activator，RTA）是ORF50编码的一种即刻早期蛋白，是促使病毒从潜伏性感染向裂解性感染转变的关键调控因子。无论是外源性还是内源性来源引起的RTA表达增高，均可介导病毒裂解性基因的级联表达[7]。一些化学物质如TPA、butyrate等可诱导KSHV的溶解性感染[8]。KSHV阳性细胞经TPA诱导后1 h就可检出RTA的表达[9]。通过Blast比对，笔者发现抗凋亡基因Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列，这里N可以为任何碱基。这些CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA反应元件 （RTA responsive elements，RREs）[10]。KSHV RTA能否与这些RRE相互作用并调节宿主细胞Bcl-2基因表达？这引起了研究者的极大兴趣。本研究主要探讨KSHV RTA上调宿主Bcl-2的分子机制。

1 材料与方法

1.1 质粒

pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2是采用 PCR 定点突变技术构建的报告质粒（引物见表1），它们分别突变了Bcl-2基因全长启动子中的9个RRE、启动子P1与启动子P2。构建pGL3-△RREs时，将PCR扩增片段（Bcl-2启动子核苷酸-1563～+1）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P2时，将启动子片段（-2744～-680）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P1时，先将启动子片段（-346～+1）插入pGL3载体MluI/HindⅢ双酶切位点处（pGL3-P2），再将片段（核苷酸-2867～-1545）插入 pGL3-P2的MluI/HindⅢ双酶切位点处。

1.2 抗体与细胞

RTA抗体用杂交瘤技术制备，由上海巴斯德研究所蓝柯实验室提供。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司，GAPDH抗体为Novus Biologicals公司产品，耦联IR Dye 800的羊抗鼠IgG购自Rockland公司。

HEK 293是原代人胚肾细胞转染腺病毒DNA的永生化细胞。BJAB为KSHV和EBVA均阴性的B细胞淋巴瘤细胞系，DG-75为未感染KSHV的Burkitt's淋巴瘤细胞。BC3和BCBL1是感染KSHV的人体腔淋巴瘤细胞系。细胞培养的方法参见有关文献[11]。

1.3 细胞转染及KSHV的诱导

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser电穿孔仪进行细胞转染，电穿孔转染的实验方法在文献中已有介绍[12]。用20 ng/mL TPA、1.5 mM butyrate诱导KSHV，未经诱导处理的细胞作为对照组。所有细胞均在诱导后培养48 h收集。

1.4 Western blot

细胞收集后加入RIPA缓冲液裂解，用Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液上样，聚丙烯胺凝胶电泳结束后，转移蛋白样品至PVDF膜，分别用Bcl-2抗体、RTA抗体、GAPDH抗体及耦联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗进行免疫印迹。用Odyssey红外线成像系统（LI-COR公司）观察结果。

1.5 RT-PCR

TRIzol（Invitrogen）法抽提细胞总 RNA，用高容量RNA-to-cDNA试剂盒（Applied Biosystems）逆转录合成cDNA。使用SYBR green实时PCR试剂盒（Applied Biosystems）进行PCR扩增，Bcl-2和GAPDH的引物见表1。10 μL反应体系含5 μL Master Mix，5 μm 的引物 1 μL，4 μL 稀释的 cDNA。反应条件为：95℃变性 5 min 后 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环。每个样品重复3次。数据采集与分析使用StepOnePlus实时PCR 系统（Applied Biosystems）。

表1 PCR扩增及报告质粒构建的引物序列

1.6 荧光素酶报告基因试验

107个 HEK 293细胞、DG75细胞共转染10 μg荧光素酶报告质粒和 0、5、10、15、20 μg RTA 表达质粒。转染后 24 h收获细胞，制备细胞裂解液。向40 μL细胞裂解液中加入25 μL荧光素酶试验底物，使用LmaxⅡ384荧光光度计（Molecular Devices）检测荧光水平。结果以3次试验值的均数与标准差表示。Western blot用来验证转染的蛋白质的表达。

2 结果

2.1 pcDNA-RTA质粒转染HEK 293、DG75细胞后，Bcl-2表达水平上调

pcDNA-RTA质粒转染 HEK 293、DG75细胞 24 h后，Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高 （图1）。HEK 293和DG75细胞瞬时转染不同剂量的RTA表达质粒，抽提细胞总RNA用于RT-PCR分析。结果表明RTA能够上调Bcl-2转录本的水平，而且具有剂量效应关系（图1A）。Western blot也进一步证实RTA能够上调Bcl-2蛋白表达水平（图1B）。

2.2 KSHV阳性的BC3、BCBL1细胞经 TPA诱导后，Bcl-2表达水平上调

应用 RT-PCR和Western blot对 TPA诱导后的 BC3、BCBL1细胞Bcl-2表达水平的变化进行检测，结果显示Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平均显著增高（图2）。未经诱导的BC3、BCBL1细胞不表达RTA蛋白，而KSHV阴性的BJAB细胞无论诱导或未诱导均不表达RTA，两者Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平也无差异。

2.3 RTA上调Bcl-2基因启动子活性

为研究RTA对Bcl-2启动子活性的调节作用，HEK 293、DG75细胞共转染10 μg全长Bcl-2启动子报告质粒和不同剂量的RTA表达质粒，转染后培养24 h收获细胞，制备细胞裂解液，进行荧光素酶报告基因检测。实验结果表明RTA能够特异性地上调Bcl-2基因启动子活性 （图3）。当RTA表达质粒转染剂量从5 μg渐增至20 μg时，HEK 293细胞的Bcl-2启动子活性增加12～35倍（图3A）；DG75细胞Bcl-2启动子活性增加5～25倍（图3B）。

2.4 P2启动子和CCN9GG样序列对RTA上调Bcl-2启动子活性具有重要作用

Bcl-2基因人有两个启动子，分别称为启动子1（promoter1，P1）和启动子 2（promoter2，P2）。 P1位于起始密码子上游约1.4kb处，没有典型的TATA盒，富含能被Sp-1结合的GC盒。P2位于起始密码子上游约80bp处，具有典型的CCAAT盒和TATA盒。在P1上游距起始密码子1.6～2.6 kb处有9个CCN9GG样RTA反应元件（图4A）。为定位Bcl-2全长启动子中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件，应用PCR定点突变技术构建了3个截短的报告质粒，命名为：pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2。 它们分别突变了 9个CCN9GG样序列、P1和P2启动子。

荧光素酶报告基因检测显示，突变P1启动子对共转染了 pcDNA-RTA和 pGL3-△P1报告质粒的 HEK 293、DG75细胞启动子活性并无影响（图4B、C），与全长启动子的活性相似（图3）。一旦突变P2启动子或9个CCN9GG样RREs，均导致共转染了pcDNA-RTA和报告质粒的HEK 293、DG75细胞启动子活性几乎完全关闭，与只转染报告质粒而无RTA表达时启动子活性相似（图4B、C）。上述结果充分说明P2启动子和9个CCN9GG样RREs对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。

3 讨论

病毒感染与细胞凋亡有密切的联系。感染细胞的凋亡可以限制病毒的复制，是机体一种抗病毒的防御机制。相应地，病毒为了在宿主体内长期生存，可通过多种途径干扰机体介导的感染细胞的凋亡，以利于病毒自身的生存与扩散[13-14]。Bcl-2蛋白是一种定位于线粒体上的膜蛋白，为Bcl-2原癌基因所编码，具有抑制细胞凋亡的功能[15-16]。Bcl-2基因在许多肿瘤细胞都高表达，不仅阻止肿瘤细胞凋亡，而且是肿瘤化疗、放疗不敏感的重要原因[17]。本研究证实KSHV RTA上调宿主细胞Bcl-2表达。在RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高。RTA可直接激活Bcl-2基因启动子，这种激活作用呈剂量依赖性，无细胞选择性。

为阐明RTA调控Bcl-2的分子机制，对Bcl-2基因启动子中的作用元件进行了鉴定。通过Blast比对发现Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列。这种CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA作用元件，存在于KSHV的5个基因 ORF57、K2、PAN、MIP和 K12启动子中[10]。 它在体外与体内都与RTA相互作用，并调节RTA的反式激活[10]。RTA可能通过与Bcl-2基因启动子中的CCN9GG样RRE相互作用上调其表达。荧光素酶报告基因检测显示，采用定点PCR突变技术突变Bcl-2基因启动子的9个CCN9GG样RRE，导致启动子活性完全关闭。因此可以认为CCN9GG样RRE对RTA介导的Bcl-2调控具有重要的作用。EBV RRE序列GNCCN9GGNG与KSHV RRE具有高度的一致性[18]，另一项有关EBV RRE的研究指出，由于N9的碱基变化，CCN9GG样RRE对RTA调控基因的转录、病毒的激活存在反应性差异[19]。KSHV亦是如此，PAN的RRE与RTA的相互作用强于K2、K12的RRE[20]。一些转录因子的结合位点在CCN9GG样RRE附近，它们可与RTA间接结合发挥调控作用。RTA既可与CCN9GG样RRE结合，也可与已经结合到顺式作用元件的转录因子形成复合物，发挥对靶基因启动子活性的最佳调节。

P2启动子为RTA调控Bcl-2所必需。突变P1后启动子活性并无降低，与Bcl-2全长启动子的活性相似；而突变P2会导致启动子活性显著降低。P2启动子具有典型的CCAAT盒和TATA盒；P1启动子富含能被Sp-1结合的GC盒，没有典型的TATA盒[21]。这可能是RTA介导的Bcl-2表达上调对P2启动子具有选择性的原因。

综上所述，KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达，CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。KSHV RTA介导的Bcl-2表达上调在宿主细胞增殖与凋亡、病毒子的产生等方面的生物学意义将在后续的研究报告中述及。

致谢：衷心感谢 Véronique Bourgarel-Rey（Aix-Marseille Université，Marseille Cedex 05，France）提供 Bcl-2 基因全长启动子荧光素酶报告质粒pGL3-Bcl-2。E.S.R.是美国白血病和淋巴瘤学会的会员。

[1]Chang Y，Cesarman E，Pessin MS，et al.Identification of herpesvirus-like DNAsequencesinAIDS-associatedKaposi'ssarcoma[J].Science，1994，266（5192）：1865-1869.

[2]Miller G，Heston L，Grogan E，et al.Selective switch between latency and lytic replication of Kaposi's sarcoma herpesvirus and Epstein-Barr virus in dually infected body cavity lymphoma cells[J].J Virol，1997，71（1）：314-324.

[3]Jenner RG，Alba MM，Boshoff C，et al.Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent and lytic gene expression as revealed by DNA arrays[J].J Virol，2001，75（2）：891-902.

[4]Sharp TV，Wang HW，Koumi A，et al.K15 protein of Kaposi's sarcomaassociated herpesvirus is latently expressed and binds to HAX-1，a protein with antiapoptotic function[J].J Virol，2002，76（2）：802-816.

[5]Haque M，Davis DA，Wang V，et al.Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus （human herpesvirus 8） contains hypoxia response elements：relevance to lytic induction by hypoxia[J].J Virol，2003，77（12）：6761-6768.

[6]Cai Q，Lan K，Verma SC，et al.Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent protein LANA interacts with HIF-1 alpha to upregulate RTA expression during hypoxia：Latency control under low oxygen conditions[J].J Virol，2006，80（16）：7965-7975.

[7]Lukac DM，Kirshner JR，Ganem D.Transcriptional activation by the product of open reading frame 50 of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus is required for lytic viral reactivation in B cells[J].J Virol，1999，73（11）：9348-9361.

[8]Lan K，Kuppers DA，Verma SC，et al.Induction of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen by the lytic transactivator RTA：a novel mechanism for establishment of latency[J].J Virol，2005，79（12）：7453-7465.

[9]Nakamura H，Lu M，Gwack Y，et al.Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator[J].J Virol，2003，77（7）：4205-4220.

[10]Wen HJ，Minhas V，Wood C.Identification and characterization of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and transcription activator （RTA）-responsive element involved in RTA-mediated transactivation[J].J Gen Virol，2009，90（Pt4）：944-953.

[11]Lu J，Verma SC，Murakami M，et al.Latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus （KSHV）upregulates survivin expression in KSHV-Associated B-lymphoma cells and contributes to their proliferation[J].J Virol，2009，83（14）：7129-7141.

[12]He Z，Liu Y，Liang D，et al.Cellular corepressor TLE2 inhibits replication-and-transcription-activator-mediated transactivation and lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus[J].J Virol，2010，84（4）：2047-2062.

[13]Galluzzi L，Catherine B，Morselli E，et al.Viral control of mitochondrial apoptosis[J].PLoS Pathog，2008，4（5）：e1000018.

[14]Cam M，Handke W，Picard-Maureau M，et al.Cytomegaloviruses inhibit Bak-and Bax-mediated apoptosis with two separate viral proteins[J].Cell Death Differ，2010，17（4）：655-665.

[15]Bourgarel-Rey V，Savry A，Hua G，et al.Transcriptional down-regulation of Bcl-2 by vinorelbine：identification of a novel binding site of p53 on Bcl-2 promoter[J].Biochem Pharmacol，2009，78（9）：1148-1156.

[16]Onyshchenko MI，Gaynutdinov TI，Englund EA，et al.Stabilization of G-quadruplex in the BCL2 promoter region in double-stranded DNA by invading short PNAs[J].Nucleic Acids Res，2009，37（22）：7570-7580.

[17]Harima Y，Harima K，Shikata N，et al.Bax and Bcl-2 expressions predict response to radiotherapy in human cervical cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，1998，124（9）：503-510.

[18]Gruffat H，Sergeant A.Characterization of the DNA-binding site repertoire for the Epstein-Barr virus transcription factor R[J].Nucleic Acids Res，1994，22（7）：1172-1178.

[19]Chen LW，Chang PJ，Delecluse HJ，et al.Marked variation in response of consensus binding elements for the Rta protein of Epstein-Barr virus[J].J Virol，2005，79（15）：9635-9650.

[20]Song MJ，Li X，Brown HJ，et al.Characterization of interactions between RTA and the promoter of polyadenylated nuclear RNA in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8[J].J Virol，2002，76（10）：5000-5013.

[21]Young RL，Korsmeyer S.A negative regulatory element in the bcl-2 5'-untranslated region inhibits expression from an upstream promoter[J].Mol Cell Biol，1993，13（6）：3686-3697.