单一pH法、pH示差法和差减法快速测定干红葡萄酒中总花色苷含量的比较

翦 祎，韩舜愈，张 波，祝 霞，王 婧，崔日宝

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070)

花色苷为花色素的糖苷，是红葡萄酒中主要的呈色物质，决定了酒的品质。在整个酿造过程中，葡萄中的花色苷会因为醪液性质的变化而发生一定的变化，同时，花色苷还具有抗氧化，抗突变、抗癌，保护心血管及神经系统，改善视力等多种生理功能［1］。因此，对葡萄酒中花色苷进行研究对于葡萄酒生产工业具有十分重要的意义。目前，常用的总花色苷的定量方法有高效液相色谱法和可见分光光度法。其中，高效液相色谱法定量测定花色苷含量精确度虽高，但设备仪器较昂贵，需要多种花色素标准品［2］，而分光光度法不需用花色苷标准品，且和HPLC具有高的相关性［3］，这使得可见分光光度法成为一种切实可行的检测方法［4］。目前常用的分光光度法包括:pH示差法、单一pH法和差减法。研究发现，花色苷的结构随pH改变有几种不同形式的转变，其结构的转变是pH的函数，而干扰物的特征光谱不随pH的改变而变化［5］。在pH示差法测定中，通过实验，确定两个对花色苷吸光度差别最大，但可保持其稳定的pH，测定这两个pH处的吸光值差异，根据公式就可以计算出花色苷的总量［6］。同时，在pH方法中，花色苷总量测定也可在一个恒定的pH介质条件下进行，此方法称为单一pH法。该方法在很少含有在花色苷的最大吸收区发生吸收的干扰物质的样品中，利用朗伯-比耳定律通过适当波长处的吸光度来测定［7］，由于操作简便，被广泛应用于花色苷含量的测定［8］。此外，酒中的花色苷可被二氧化硫或亚硫酸盐等物质漂白，漂白后其在可见光的光谱特征消失，而酒中花色苷的干扰物吸光度则很少受影响。利用葡萄酒样品漂白前后吸光度的差值，参考标准工作曲线，便可计算出相应的含量［7］。本文以干红葡萄酒为实验原料，讨论分光光度法测定干红酒总花色苷含量的分析条件，并比较各方法之间的差异，以期为葡萄酒中的总花色苷含量检测提供一种简单有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干红葡萄酒 市售;锦葵色素-3-葡萄糖苷标准品 美国草药药典公司;盐酸、氯化钾、乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、亚硫酸钠 分析纯，天津光复科技有限公司。

pH为0.5～2.0的缓冲溶液(0.1mol/L柠檬酸溶液逐滴加入盐酸，pH计校正配制);pH1.0的缓冲溶液(0.2mol/L KCl∶0.2mol/L HCl=25∶67，v/v);pH4.5的缓冲溶液(0.2mol/L NaAc·3H2O∶0.2mol/L HAc=1∶1，v/v);pH 为3.0～6.0 的缓冲溶液(0.1mol/L 柠檬酸和0.1mol/L柠檬酸钠，pH计校正配制)。

UV756CRT紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;CP214型电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司;HH-S型恒温水浴锅 恒丰仪器制造有限公司;Metrohm 827 pH Lab pH计 瑞士万通公司。

1.2 实验方法

1.2.1 测定波长的选择 由于本研究的样品是葡萄酒，其花色苷组成很复杂，可以选择标准品来表示干红酒样中花色苷的含量，以锦葵色素-3-葡萄糖苷为标准来表示［9］。

将锦葵色素-3-葡萄糖苷用pH1.0的缓冲液配制成25mg/L的标准溶液，使其吸光值在分光光度计的线性范围内(0.2～1.4AU)［9］，在 200～800nm 下进行全波段(光谱)扫描，确定最大测定吸收波长。空白对照用pH1.0的缓冲溶液。

1.2.2 锦葵色素-3-葡萄糖苷标准曲线的绘制 将锦葵色素-3-葡萄糖苷用pH1.0的缓冲液分别配制成 5、10、15、20、25、30mg/L 的标准溶液。空白样品在用缓冲液定容前加入0.5mL 10%亚硫酸钠溶液。在最大吸收波长处测定吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.3 pH示差法测定条件的选定

1.2.3.1 pH的选定 为使pH示差法有较好的灵敏度及准确性，pH的选定对花色苷的定量分析具有重要的意义，由于花色苷只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定pH小于7条件下花色苷吸光值的变化［10］。

分别吸取1mL样品于9个试管中，再分别加入pH 为 0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的缓冲溶液9mL，平衡120min后，以蒸馏水为空白对照，于最大波长下测定吸光度。

1.2.3.2 平衡时间的确定 因为花色苷在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一pH下处于动态平衡，当pH改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是:pH降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动;pH升高时平衡向蓝色醌式移动，一定时间后达到一个新的平衡。因此，样品用缓冲液稀释后，须静置一段时间，等稳定后才能测定［10］。

吸取样品1mL，再加入pH为1.0的缓冲溶液9mL，以蒸馏水为空白在室温下分别平衡10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min，于最大波长下测定吸光度。用同样的方法测pH为4.5的缓冲溶液的平衡时间。

1.2.4 pH示差法测总花色苷含量 分别吸取葡萄酒 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH 1.0的缓冲液定容至10mL。室温平衡100min后，以蒸馏水为空白，分别在最大吸收波长和700nm处测定吸光值。用同样的方法测样品在pH为4.5的缓冲溶液中的吸光度值。

1.2.5 单一pH法测总花色苷含量 分别吸取葡萄酒 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH 1.0的缓冲液定容至10mL。室温平衡100min后，以蒸馏水为空白，在最大吸收波长处测定吸光值。

1.2.6 差减法测总花色苷含量 分别吸取葡萄酒0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH1.0 的缓冲液定容至10mL。室温平衡100min后，在最大吸收波长处测定吸光值。样品的漂白处理是取相同量的葡萄酒在定容前加入0.8mL 20%的Na2SO3溶液。

1.2.7 经验公式计算方法 pH示差法［9］:花色苷色素含量(mg/L-A700nm)pH1.0-(Aλmax-A700nm)pH4.5;MW(分 子 量)=493.2g/mol(锦葵色素-3-葡萄糖苷);DF=稀释倍数;1=光程的厘米数;ε=28000摩尔消光系数(锦葵色素-3-葡萄糖苷)单位是L· mol-1·cm-1。

单一 pH 法［11］:

式中:A=Aλmax;其他与pH示差法相同。

差减法［7］:

式中:A1和A2分别为亚硫酸钠漂白前后的溶液吸光度;k为采用锦葵色素-3-葡萄糖苷标准品绘制的标准曲线的斜率。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

利用可见分光光度计进行全波段扫描，扫描结果见图1。由资料可知，花色苷的最大吸收区通常在500～550nm［12］范围内，故锦葵色素-3-葡糖苷的最大吸收峰波为521nm。

图1 锦葵色素-3-葡萄糖苷光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of alvidin-3-glucoside

2.2 锦葵色素－3－葡萄糖苷标准曲线

在最大吸收波长521nm下，检测不同浓度锦葵色素-3-葡萄糖苷的吸光值，如图2所示，其线性方程为y=0.0425x-0.0067，线性相关系数R为0.9989。

2.3 pH示差法测定条件的选定

图2 锦葵色素-3-葡萄糖苷标准曲线Fig.2 Standard curve of alvidin-3-glucoside

2.3.1 pH的选定 根据示差法测定的原理，对pH进行选择。在选择时应考虑以下三个因素:a.两个不同pH处测定的花色苷吸光值差异应最显著;b.单一pH的轻微变动，对花色苷吸光值的影响较小;c.花色苷在两个pH下应相当稳定［13］。根据以上的因素，结合图3数据可知，葡萄酒花色苷在pH为1.0和4.5处时吸光度的差值最大，并且在此两处pH附近吸光度变化较小，因此选择1.0和4.5为示差法测定花色苷的pH。

图3 样品在不同pH下测定的吸光值Fig.3 Absorbance value of samples under different pH

2.3.2 平衡时间的确定 图4和图5分别反映pH为1.0和4.5时，干红葡萄酒在不同时间下吸光度的变化情况。结果表明，葡萄酒中的花色苷在缓冲液中的吸光度值随时间的延长而变化，并呈现不同的趋势。在pH1.0的缓冲液中，花色苷的吸光值随时间的延长而逐渐上升，在100min时基本稳定。在pH4.5的缓冲液中，花色苷的吸光值随时间的延长而快速下降，在50min时趋于稳定。因此，根据上述的数据进行综合考虑，平衡时间选择为100min。

图4 样品吸光度随时间的变化(pH=1.0)Fig.4 Change of sample absorbance with time

2.4 三种测定方法的比较

经测算由经验公式［9］得葡萄酒花色苷含量为231.8mg/L，在葡萄酒总花色苷浓度的线性范围内，将原液分别稀释为10到100倍。

图5 样品吸光度随时间的变化(pH4.5)Fig.5 Change of sample absorbance with time

图6 pH示差法测总花色苷的含量Fig.6 Determination of total anthocyanins by pH-differential method

图7 单一pH法测总花色苷的含量Fig.7 Determination of total anthocyanins by single pH method

由图6～图8可知，当用pH示差法、单一pH法及差减法测定干红葡萄酒中总花色苷浓度时，其相关系数均接近 1(R分别为 0.9977，0.9988和0.9984)，表明变量之间的线性相关程度较高，可见这3种方法能比较准确的测定干红酒中总花色苷含量。

图8 差减法测总花色苷的含量Fig.8 Determination of total anthocyanins by substraction method

2.5 三种方法测定结果的差异性

用DPS软件，采用Bonferroni测验比较3种方法的差异性(表1)。由表中数据可知，三种方法的标准偏差均较低，说明方法的重现性较高，且各方法之间置信区间均包括0，故3种处理方法的差异不显著(p＜0.05)。

表1 三种方法测定结果的差异性比较Table 1 Comparison of difference between the results of three methods

3 结论

3.1 用分光光度法测定干红葡萄酒中的花色苷含量，最大吸收波长为521nm。

3.2 在pH示差法测定中，选择pH1.0、pH4.5和室温下平衡100min为其测定的条件。

3.3 单一pH法、pH示差法和差减法测定溶液的吸光度与花色苷浓度的线性关系良好，相关系数R分别为0.9988、0.9977 和0.9984。

3.4 通过Bonferroni检验表明三种方法的测定结果没有显著性差异(p＜0.05)，均可用于干红葡萄酒中总花色苷含量的测定。

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