真空渗透离心法提取燕麦抗冻蛋白工艺的研究

金 涛，张 英，任 玮，张艳杰，张 晖，钱海峰，齐希光，王 立，*

(1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;2.中国食品发酵工业研究院，北京100027)

抗冻蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)又叫热滞蛋白(Thermal Hysteresis Prioteins，THPs)，最显著的特性是其具有热滞活性(Thermal Hysteresis Activity，THA)［1］，能够降低水溶液的冰点，但对熔点的影响较小，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现一定的差值。另外，AFPs还具有其他两个重要特征:冰晶形态效应和重结晶抑制效应［2］。有关抗冻蛋白的研究主要集中于动物抗冻蛋白方面，最先从鱼类中发现抗冻蛋白［3］;对于植物抗冻蛋白的研究相对较少，而像燕麦籽粒这样具有较硬外壳的、不易提取的研究更少。本研究对真空渗透离心法提取燕麦质外体抗冻蛋白进行了探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

燕麦 购自于当地超市;六磷酸葡萄糖(G6P)、NADP·Na4、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、柠檬酸 分析纯;缓冲液 Tris-HCl;PBS，Na2HPO4-柠檬酸(pH7.4;50mmol/L Na2HPO4∶25mmol/L 柠檬酸溶液(v/v)=18.17∶1.83)。

DSC-7差热分析仪 Perkin Elmer Pyris;UV7504紫外光分光光度计 上海市实验仪器总厂。

1.2 实验方法

1.2.1 质外体蛋白的提取 提取方法参考Smallwood等［4］报道的方法，实验中略微做了改动。低温下保存的燕麦用去离子水冲洗3次后，用滤纸吸取表面多余的水分，将燕麦装入烧杯，用3倍体积预冷的缓冲液(50mmol PBS，pH8.0)浸泡一定时间，再将烧杯放入真空干燥器中，抽真空至一定真空度。维持一段时间后，将气压缓慢恢复到正常大气压水平，室温下放置5min，让多余的提取液流出。用滤纸轻轻吸干，然后将燕麦放入合适的离心管中，离心，上清液再通过高速旋转冷冻离心机10000r/min离心15min，上清液即为燕麦质外体蛋白提取液。

1.2.2 总蛋白的提取 参考周露等人［5］关于水稻幼苗质外体蛋白的方法。称取燕麦50g，用预冷的缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH7.5)100mL浸泡放置冰箱中冷藏12h，冰浴将燕麦保持低温状态进行初步捣碎，再加入液氮研磨，研磨时加入0.4g SiO2。收集研磨后的粉末并加入100mL的缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH7.5，含 0.2mol/L KCl，20mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA，1%TX-100，5mmol/L DTT，1mmol/L PMSF)来提取蛋白。用超声波细胞粉碎器裂解细胞，每次超声的时间为10s，两次超声的时间间隔为60s，共超声 10次。然后将组织匀浆于 25℃，16000g，离心30min，取上清，即为蛋白提取液。

1.2.3 蛋白提取率检测 采用Bradford方法进行蛋白提取率测定［6］，以标准牛血清白蛋白(BSA)为标准物，绘制标准曲线。再测定同等条件下待测样品在595nm处的吸光光度值，根据测得的吸光光度值，即可计算出待测样品的蛋白含量。

1.2.4 G6PDH酶活检测 六磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)活性检测是通过检测5min内340nm吸收峰的变化情况来判断［7］。按照1mL的反应体系配制测活反应液:将 850μL pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl，50μL 10mmol/L MgCl2，50μL 60mmol/L G-6-P，50μL 20mmol/L NADP·Na4充分混匀后，向上述反应液中加入50μL的质外体蛋白或者总蛋白提取液，迅速混匀，立即监测340nm处吸光光度值(A340)的变化，通过上升斜率计算反应速度，以此计算酶活效率，并设置不含蛋白提取液的对照来进行校正。样品污染率计算见式(1)，酶活力单位的计算见式(2)。

式中，Vt:反应液总体积，本实验为0.85mL;ΔA/Δt:每分钟吸光度变化值，实际根据初速度法取酶促反应第一分钟的ΔA，先后测3个平行样取平均值;e:摩尔吸光系数，NADH在340nm处的毫摩尔消光系数为6.22;L:比色杯光径(cm)，本实验中采用光径0.5cm的比色杯;Vs:样品体积，本实验为0.05mL。因此可得式(3)。

1.2.5 DSC法测定样品THA THA反映了样品冰点和熔点之间的差别，要准确的测定THA，首先要解决的问题就是避免溶液发生过冷现象，采用DSC法对样品进行退火处理，可以有效避免过冷状态发生。将10μg样品密封于铝制坩埚中，放置在样品池中央，当设备稳定后，首先降温至-30℃，然后升温至25℃，再降温至-30℃，记录体系结晶热(ΔHm)和样品熔点(Tm)。接着，缓慢升温至样品体系为固液混合物的状态，称为保留温度(Th)，停留2min，再将温度从Th降低至-30℃，重复上述过程，在不同的Th下停留2min，分别记录不同Th下样品体系开始结晶的温度(To)，以及结晶热(ΔHf)。以纯水作为对照。冰晶含量(Φ)和THA分别为式(4)、(5)。

式中，Φ为样品中的冰晶含量;ΔHf为保留温度停留后继续降温过程中体系的放热焓;ΔHm为样品结晶的总放热焓［8］。

式中，THA为样品的热滞活性，Th为保留温度，To为不同保留温度下体系的开始结晶温度。

1.2.6 水分、灰分、蛋白质含量的测定 分别参照GB5009.3-2010、GB5009.4-2010、GB5009.5-2010。

1.2.7 实验设计 在燕麦质外体蛋白的提取过程中，缓冲液的种类、浸泡的时间、真空度、真空时间对燕麦质外体抗冻蛋白提取都有很大的影响。因此，本文蛋白提取率以及蛋白的污染程度为指标，考察了缓冲液种类、浸泡时间、真空时间、真空度、离心时间、离心转速等6个因素对蛋白质提取率以及样品污染率的影响。

2 结果与讨论

2.1 燕麦的基本成分

经测定，燕麦的水分含量、灰分含量和蛋白质含量分别为10.07%、1.56%和10.58%。

2.2 缓冲液种类对蛋白质提取率以及样品污染率的影响

Tris-HCl、PBS和Na2HPO4-柠檬酸是几种常用的缓冲液，因此采用此三种缓冲液为基础缓冲液，并采用上述方法测定其蛋白浓度，计算提取效率结果如图1。从图1可以看出，使用 Tris-HCl、PBS、水、Na2HPO4-柠檬酸作为缓冲液，蛋白质提取率分别为0.034、0.058、0.019、0.050mg/g。可见采用 PBS 缓冲液浸泡的燕麦蛋白提取率较其他三种更高，其蛋白提取率比Tris-HCl、水和Na2HPO4-柠檬酸分别提高了70.6%、205.2%和16%。

图1 不同缓冲液对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of buffer on the extraction efficiency of proteins

由图2可以看出，通过计算质外体蛋白的酶活活性与总蛋白酶活活性的比值，计算得到样品的污染率［5］。Tris-HCl、PBS 和 Na2HPO4-柠檬酸的蛋白提取液污染率分别为2.7%、1.3%和2.7%。经t检验分析3种蛋白提取液的污染率之间没有显著差异。而据相关文献报道，污染率低于3%即可视为无明显污染［9］。而这3种提取液的污染率均远远低于此标准，采用PBS为缓冲液得到的提取液的污染率略低与另两种，提取到的质外体蛋白纯度较高，所以选PBS为缓冲液。

图2 不同缓冲液种类对质外体蛋白质污染率的影响Fig.2 Effect of buffer on the contamination ratio in the apoplast protein

2.3 浸泡时间对蛋白质提取率以及样品的污染率的影响

由于燕麦籽粒有壳层包裹，直接抽真空无法提取到较多的质外体蛋白，故实验设计先使燕麦在缓冲溶液中浸泡一定时间，使缓冲溶液充分的渗透，进而再抽真空。选取15、30、45、60、75、90min 6 个时间段研究提取到质外体蛋白的最佳浸泡时间。

由图3可以看出浸泡时间为60min，蛋白提取效率达到最高。在15～60min浸泡时间内，蛋白提取率提高较为明显;60～90min浸泡时间内，蛋白质得率几乎没有变化，说明在浸泡时间在60min左右时，缓冲液已完全渗透。

图3 缓冲液浸泡时间对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of soaking time on the extraction efficiency of proteins

由图4得，在浸泡时间为 45、60、75、90min时蛋白质污染率均为1.3%，表明不同浸泡时间对质外体蛋白质的提取几乎没有污染，所以综合蛋白质提取率和污染率选取浸泡时间为60min较合适。

图4 浸泡时间对质外体蛋白质污染率的影响Fig.4 Effect of soaking time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.4 真空时间对蛋白质提取率以及样品的污染率的影响

真空处理时间的长短对蛋白质的提取效率会产生一定的影响，真空时间过长则容易造成细胞膜破裂，从而导致细胞内蛋白污染;反之则会使蛋白产率显著降低，蛋白种类减少。根据以往文献［10］报道，一般提取质外体蛋白时采用的真空度都是30～40kPa，处理时间是30min。由于燕麦籽粒的外壳不易渗透，实验中适当延长真空处理的时间，与通常方式的30min相比，60min的蛋白质提取率比30min的蛋白质提取率提高了17.1%。图5结果显示真空处理时间在60min时蛋白质提取率到达最高点，说明延长真空时间对蛋白质的提取率有一定的提高。

图5 真空时间对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of vacuum time on the extraction efficiency of proteins

真空时间所影响的主要方面在于对于质外体蛋白的污染情况，时间延长会使细胞发生破裂，由图6得，真空时间在45min和60min下吸光光度几乎没有变化，污染率均为1.3%，而真空时间在75min和90min下的污染率分别是2.7%和4.0%，表明真空时间太长，蛋白质污染率会提高，且当真空时间90min时，已经超过了3%，说明有明显污染，因此选择真空时间为60min。

图6 真空时间对质外体蛋白质污染率的影响Fig.6 Effect of vacuum time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.5 真空度对蛋白质提取率以及样品的污染率的影响

由图7可知，真空度对蛋白质的提取率影响比较明显，真空度为0.20MPa下，蛋白质的提取率较低，为0.018mg/g;随着真空度的升高，提取率显著提高，但通过与传统的0.30MPa的真空度相比，0.35MPa的真空度提取率提高了25%。在真空度上升到0.35MPa时，蛋白质的提取率到达最大，之后再增加真空度则不会再有明显提升，因此，在真空度选择为0.35MPa时蛋白质的提取率较高。

图7 真空度对蛋白质提取率的影响Fig.7 Effect of vacuum degree on the extraction efficiency of proteins

由图8可知，真空时间的提高对于蛋白质的污染率的提高较真空度对于蛋白质污染率的影响更大一些，综合对蛋白质的提取率和蛋白质的污染率的影响比较，真空度选择0.35MPa。

图8 真空度对质外体蛋白质污染率的影响Fig.8 Effect of vacuum degree on the contamination ratio in the apoplast protein

2.6 离心转速对蛋白质提取率以及样品的污染率的影响

由图9可知，在离心转速为3500r/min的情况下，蛋白质的提取率最高，比离心转速为2000r/min时的蛋白质提取率高220%，而继续提高转速，提取率没有增加。

图9 离心转速对蛋白质提取率的影响Fig.9 Effect of the centrifugal speed on the extraction efficiency of proteins

由图10可知，当离心转速在3500r/min时，蛋白质的污染率有所提高，可能随着离心力的增大，细胞质内的蛋白随之离心出来，质外体蛋白受到污染。总结蛋白质的提取率和蛋白质的污染情况，3500r/min下的提取率较3000r/min稍高，但污染率较高，所以实验选择3000r/min。

图10 离心转速对质外体蛋白质污染率的影响Fig.10 Effect of centrifugal speed on the contamination ratio in the apoplast protein

2.7 离心时间对蛋白质提取率以及样品的污染率的影响

由图11可知，当离心时间在25min左右时，质外体蛋白已基本离心出来，再延长离心的时间对于蛋白质的提取率没有明显影响。离心时间在25min时蛋白质的提取率比离心时间为10min的蛋白质提取率高115%。

图11 离心时间对蛋白质提取率的影响Fig.11 Effect of centrifugal time on the extraction efficiency of proteins

由图12可知，不同的离心时间下，所得的吸光度值几乎没有变化，污染率均为3.1%，基本无细胞质内蛋白污染，综合考虑提取率和污染率，选择离心25min。

图12 离心时间对质外体蛋白质污染率的影响Fig.12 Effect of centrifugal time on the contamination ratio in the apoplast protein

2.8 验证实验

综上所述，燕麦质外体抗冻蛋白的最佳提取工艺为:燕麦籽粒经去离子水多次冲洗净之后，在50mmol、pH8.0中PBS缓冲液浸泡60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下离心25min，再经高速低温10000r/min离心15min。在此条件下进行验证实验得到燕麦质外体蛋白提取率为0.085mg/g，细胞内蛋白质污染率为1.3%。

2.9 燕麦质外体抗冻蛋白热滞活性的测定

从表1中可以看出，将停留温度Th从-4.53℃逐渐升高至-3.88℃，冰晶含量逐渐降低，而热滞活性逐渐升高。已有的研究结果认为冰晶含量与Th是密切相关的，Th越接近熔化点，冰晶含量越低;反之亦然。表中也显示冰晶含量随着停留温度的增高而降低，热滞活性随着停留温度的增高而增大，这与已有的研究［11］相符。从图13中也可以看出:当样品再次冷却时，结晶峰并不光滑，出现延滞现象，即结晶起始温度与保持温度存在差异，这表明燕麦质外体蛋白具有热滞活性，能够降低冰点。

图13 燕麦质外体抗冻蛋白的热滞活性Fig.13 THA of oat apoplast antifreeze protein

表1 质外体蛋白的停留温度、冻结起始温度、熔点、冰晶核含量和热滞活性Table 1 The hold and onset temperatures(Th and To)，the exothermic enthalpy under different hold temperature and the totle system(ΔHf and ΔHm)，the amount of ice nuclei，and the thermal hysteresis activity(THA)of the apoplast antifreeze protein

3 结论

本研究得到燕麦质外体抗冻蛋白的最佳提取工艺为:燕麦籽粒经去离子水多次冲洗净之后，在三倍体积 50mmol、pH8.0PBS缓冲液浸泡 60min后，0.35MPa下抽真空60min，然后在3000r/min下离心25min，再经高速低温10000r/min离心15min，再经冷冻，干燥。燕麦质外体蛋白提取率为0.085mg/g，细胞内蛋白质污染率为1.3%。经优化工艺提得燕麦质外体蛋白质经DSC检测，证明所得蛋白具有明显的热滞活性，THA为2.07℃。

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