响应面法优化南极磷虾壳中虾青素提取条件的研究

张晓燕，刘 楠，朱兰兰，周德庆，*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071;2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003)

虾青素(Astaxanthin)全称 3，3＇-二羟基-4，4＇-二酮基-β，β＇-胡萝卜素，属于非维生素A源类胡萝卜素，不溶于水，易溶于二氯甲烷、丙酮、氯仿等大多数有机溶剂［1］。虾青素具有高效抗氧化［2-3］、抗癌变［4］、增强免疫［5-6］及着色等功能［7］，近年来受到食品、医药、化妆品、水产养殖等行业的关注［8］，人们对于生产天然虾青素表现出极大的兴趣。目前从甲壳类中提取天然虾青素是生产的主要途径之一。南极磷虾在南极生态系统中起着至关重要的作用，是整个南大洋生态系统中能量和物质流动的关键环节［9］。南极磷虾生物量巨大，约为 6.5～10 亿 t［10］，最近几年的年捕捞量为十几万吨［11］。南极磷虾体内虾青素含量丰富，有研究表明其体内高于95%的色素都以虾青素的形式存在。近年来随着市场对于天然虾青素的需求越来越大，南极磷虾作为一种重要的渔业资源，越来越受到人们的重视。本文研究南极磷虾壳中虾青素提取过程中各参数对其提取率的影响，采用响应面法对提取条件进行优化，得到最优提取条件，为南极磷虾的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾 由辽宁省大连海洋渔业集团公司提供，冷冻方式运到实验室并在-20℃冰柜中贮藏;虾青素标准品(纯度98%以上)购于Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国;浓盐酸、二氯甲烷等试剂 均为分析纯。

BSA124S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;T6新锐-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DHG-9023型电热恒温鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司;SHZ-82恒温振荡器 常州国华仪器有限公司;A-1000S型水流抽气机 上海爱朗仪器有限公司;Milli-Q Advantage超纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制及样品含量的测定

1.2.1.1 标准曲线的绘制 采用二氯甲烷溶剂为提取剂，称取2.5mg虾青素标准样品，溶于二氯甲烷溶剂，配制成虾青素标准溶液，于400～700nm光波长范围内扫描最大吸收波长及吸光值。实验结果表明虾青素在二氯甲烷溶液中最大吸收波长为480nm，标准曲线方程见式(1)。

式中:x-虾青素浓度，μg/mL;y-溶液吸光值A。线性回归相关系数显著，表明虾青素质量浓度在0～6μg/mL范围内具有线性关系。

1.2.1.2 样品含量的测定 按式(1)得出粗提液中虾青素的浓度，从而得到虾青素提取率。公式见式(2)

式中:x-虾青素浓度，μg/mL;V-虾青素粗提液体积，mL;N-稀释的倍数，本实验中为10;M-虾壳湿重，g。

1.2.2 单因素实验 参考相关的文献资料［12-14］，以虾青素提取率为指标，进行单因素实验考察二氯甲烷料液比、提取时间、提取温度和提取级数对虾青素提取率的影响。实验因素及其水平见表1。

表1 单因素实验水平表Table 1 Factors and levels of single-factor experiment

1.2.3 响应面实验 在单因素实验结果的基础上，采用 Design Expert(Vision 7.1.6)软件，按照 Box Benken设计原理，以虾青素提取率作为响应函数，选取适当的响应面因素及其水平，通过响应曲面分析回归得出自变量与响应函数之间的统计模型，确定虾青素提取最佳工艺条件。实验因素水平编码如表2所示。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels of RSM

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对虾青素提取率的影响 由图1可得出，在本次实验范围内，料液比为1∶5g/mL时，虾青素的提取率达到最大值;整个曲线呈先上升后下降趋势，可能是因为料液比低时，虾壳与二氯甲烷接触不充分，提取不完全导致提取量低;而料液比过高时，提取液的体积大导致虾青素受光、热的破坏变多，虾青素分解或变性，提取量随之降低。因此选取1∶4、1∶5、1∶6g/mL 作为料液比的响应面水平。

图1 不同提取料液比的效果比较Fig.1 Effect of ratio on astaxanthin extraction

2.1.2 提取时间对虾青素提取率的影响 由图2可得出，在本次实验范围内，提取时间为7h时提取率最大;而超过7h，提取率反而略有下降。分析原因可能是由于虾青素提取完全需要一段时间保证虾壳与二氯甲烷溶剂充分接触，提取时间短，接触不充分使得提取率低;提取时间过长则引起虾青素的分解或变性。因此选取6、7、8h作为提取时间的响应面水平。

图2 不同提取时间的效果比较Fig.2 Effect of time on astaxanthin extraction

2.1.3 提取温度对虾青素提取率的影响 由图3可知，本次实验范围内，30℃下虾青素的提取率最大。低于30℃时，虾青素与二氯甲烷反应不充分，不能完全浸提;温度提高，虾青素本身的不稳定性造成分解或者变性，导致提取率下降，因此选取20、30、40℃作为提取温度的响应面水平。

图3 不同提取温度的效果比较Fig.3 Effect of temperature on astaxanthin extraction

2.1.4 提取级数对虾青素提取率的影响 按3次提取总量为100%计，由表3中每级提取率可以看出，二级提取后虾青素已经大部分被提取，三级提取率很小。从经济等各角度综合考虑，最终确定最佳提取级数采用二级。

表3 不同提取级数的效果比较Table 3 Effect of times on astaxanthin extraction

2.2 响应面模型拟合

当多因素影响提取效果时，响应面是一种有效的优化方法［15］。虾青素提取实验结果见表4，利用Design Expert V7.1.6软件对实验结果进行分析。通过逐步回归对实验数据(表4)进行回归拟合，得到料液比、提取温度、提取时间3个自变量的二次多项回归方程:

Y=-2.169.3278+4346.40822A+38.16529B+365.34574C-26.34848AB-213.85606AC-0.496BC-4977.95833A2-0.47987B2-22.00975C2

表4 响应面设计与实验结果Table 4 Test design and results of RSM

进一步对该回归模型进行方差分析，结果见表5。由表5可知，模型p＜0.01，表明模型极显著，不同处理间的差异极显著。失拟项反映实验数据与模型不相符的情况，该模型的失拟项(p＞0.05)不显著，说明模型选择正确。模型的决定系数R2=0.9989，矫正决定系数 Adj R2=0.9975，表明响应值变化的99.75%能用该模型来解释，故该模型拟合程度好，实验误差小，可有效分析和预测二氯甲烷溶剂提取虾青素的效果。此外，从方差分析中还可以看出该实验条件范围下各参数对提取效果影响的大小顺序:提取温度＞提取时间＞料液比。

2.3 响应面分析

响应面图形是响应值对各实验因素所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可以找出最佳参数以及各参数之间的相互作用，而等高线的形状可以反映出各因素之间的交互作用的强弱趋势［16］。根据回归分析结果制作等高线及响应曲面见图4～图6。通过等高线和响应曲面图确定各因素的最佳水平范围以及各因素之间的交互作用强弱。

图4显示了料液比和提取温度对虾青素提取率的影响，从图中可以看出当提取温度恒定时，虾青素提取率随着料液比的增大，呈先上升后缓慢下降的趋势，这和单因素实验结果是一致的。可见选择适当的料液比和提取温度，既可以得到较高的虾青素提取率同时可以达到环保经济的目的。由响应面图的形状可以看出料液比和提取温度两者间的交互作用显著。

表5 回归模型系数方差分析Table 5 ANOVA for the regressioncoefficients of model

图4 料液比和提取温度对提取率的影响Fig.4 Interactive effects of ratio and temperature on astaxanthin extraction

图5显示了料液比和提取时间对虾青素提取率的影响，从图中可以看出提取时间对虾青素提取率的影响显著，当提取时间超过7h后，虾青素提取率随着提取时间的延长而迅速下降，原因可能是虾青素不稳定性，在空气中暴露的时间越长，分解或变性越严重，导致虾青素提取量下降。由响应面图的形状可以看出料液比和提取时间之间的交互作用较显著。

图5 料液比和提取时间对提取率的影响Fig.5 Interactive effects of ratio and time on astaxanthin extraction

图6显示了提取温度和提取时间对虾青素提取率的影响，从图中可以看出当提取时间一定时，虾青素提取率随着提取温度的升高而迅速提高。因为虾青素的不稳定性，随着温度的提高，虾青素分解或变性的可能性变大，因此提取温度过高对虾青素提取率的影响是负面的。由响应面图的形状可以看出，提取温度和提取时间两者之间的交互作用显著。

图6 提取温度和提取时间对提取率的影响Fig.6 Interactive effects of temperature and time on astaxanthin extraction

2.4 提取条件的优化及验证

对二次多项回归模型进行最优求解，得出二氯甲烷溶剂提取虾青素过程中提取料液比、提取温度以及提取时间对于提取率的最优值分别为1∶4.76g/mL、30.5℃、6.95h，虾青素提取率理论最大值为131.591μg/g(湿重)。为实际操作方便，确定最优条件是料液比为1∶5g/mL，提取温度为30℃，提取时间为7h。为检验结果的可靠性，采用响应面优化的最佳条件进行3次验证实验，实验得出的131.56μg/g(湿重)，与理论值接近，说明模型能较好地预测虾青素提取情况。

3 结论

本次实验采用响应面优化实验，对南极磷虾壳中虾青素提取工艺进行研究，得到了最佳提取条件是料液比为1∶5g/mL，提取温度为30℃，提取时间为7h，提取级数为2级。此条件下虾青素提取率为131.56μg/g(湿重)。本实验采用二氯甲烷溶剂直接萃取法，方法简单，设备要求低，而且有机溶剂可以有效的回收利用，比较适合于工业化生产，通过实验得到了一个较为理想的提取虾青素模型，为虾青素的进一步开发利用奠定了基础。

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