大孔树脂D392对莱鲍迪苷A和甜菊苷吸附作用的研究

叶发银，杨瑞金，华 霄，赵 伟，张文斌

(江南大学食品学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

甜菊糖苷是从菊科草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的茎、叶中提取的天然产物，因其高甜度、低热值、性状稳定、安全无毒，在食品中的应用日益广泛［1］。已知的10种甜菊糖苷中，甜度约为蔗糖的250～300倍，但具有明显的后苦味［1］;RA 甜度最高(约为蔗糖的350～450倍)、口感最接近蔗糖［2］。因此，提升甜菊糖苷品质的关键在于提高产品中RA的含量和纯度。甜菊糖苷的制备工艺一般包括提取、除杂脱色、喷雾干燥等步骤，为了进一步降低杂质含量或提高RA的含量，要对产品进行精制［3］。重结晶法［4-5］和溶析结晶法［6］利用 RA 与其他组分的溶解性差异对RA进行纯化，上述工艺能耗较大，晶体生长慢，耗时较长，且存在有机溶剂残留问题。高速逆流色谱法可以同时分离S(纯度98.3%)和RA(纯度97.6%)，该工艺对设备要求较高，溶剂系统优化耗时费力，离实际应用仍有一定差距［7］。树脂分离技术是基于吸附选择性发展起来的新型分离技术，具有低能耗、过程环保、操作方便等优点，已用于甜菊糖苷的提取分离［8-9］。研究发现，含酮基［10］、吡啶基［11］树脂和 D107、D108 树脂［12］对 RA 具有吸附选择性。这种吸附选择性是由于极性和溶解性差异使得溶质与树脂的亲和性有所不同。有学者将数种大孔吸附树脂按一定比例混合装柱，用于纯化RA，此法集中了不同树脂的吸附选择性［13-15］。本工作从各种氨基树脂中筛选吸附选择性较高的树脂，考察了影响树脂吸附选择性的因素，并利用吸附法制取了富含RA的甜菊糖苷。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大孔树脂 D380、D392、D301T、D301R 天津南开和成科技有限公司;大孔树脂D301、D303、D315、HZ-9、凝胶型335树脂 上海华震科技有限公司;D890 浙江争光实业有限公司;D201、D296、D301-G江苏苏青水处理工程集团有限公司;凝胶型717树脂 国药集团化学试剂有限公司;普通甜菊糖(总苷含量＞90%，RA含量25%)、RA(纯度98%)山东济宁奥星甜菊制品有限公司;甜菊糖苷提取物(RA含量70.3%)、S(纯度95%)实验室自制。

LaChrom Elite L-2000高效液相色谱仪 日本Hitachi公司;BS 224 S型电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;RW20型机械搅拌器 德国IKA公司;SHA-2A型冷冻水浴恒温振荡器 江苏金坛亿通电子有限公司;FEP20-FiveEasy PlusTMpH计 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂预处理 树脂的预处理按照文献［8］进行。

1.2.2 RA和S的定量分析 HPLC色谱条件:色谱柱Asahipak NH2P-50 4E(4.6mm×250mm;日本Shodex公司);流动相:乙腈-水(75/25，v/v)，流量1.0mL/min;柱温 35℃;检测波长 210nm;进样量10μL。S的工作曲线在0.1～5.0g/L线性良好，曲线方程 A1=1507830C1+183448(R2=0.999，n=6)，式中A1为S峰面积，C1为S质量浓度(g/L);RA的工作曲线在0.1～7.5g/L线性良好，曲线方程 A2=1245797C2+177463(R2=0.999，n=6)，式中 A2为RA峰面积，C2为RA质量浓度(g/L)。

1.2.3 树脂的筛选 根据14种树脂对RA和S的静态吸附率、静态解吸率和吸附残液中RA/S比值来筛选树脂。按文献［15］测定树脂含水量。在具塞锥形瓶中加入相当于干基重1.00g预处理树脂和混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，于298.15K恒温振荡器振荡(150r/min)12h，将树脂和吸附残液过滤，树脂用20mL乙醇-水(20/80，v/v)解吸。HPLC分析吸附残液中RA和S含量，并把吸附残液中RA/S(色谱图中RA和S峰面积之比)作为衡量树脂吸附选择性的依据。平衡吸附量、静态吸附率、静态解吸率分别按式(1)～式(3)计算。

式中，qe-溶质的平衡吸附量(mg/g);C0-吸附前溶质浓度(g/L);Ce-吸附平衡时溶质浓度(g/L);Vi-混合糖苷水溶液体积(L);M-树脂含水量;W-湿树脂质量(g);Cd-解吸液溶质浓度(g/L);Vd-解吸液体积(L)。

1.2.4 吸附动力学实验 取相当于干基重1.00g预处理树脂，加入5g/L混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，于298.15K恒温振荡器(150r/min)中进行吸附。一定时间间隔取样100μL进行HPLC分析，直至吸附平衡。

1.2.5 吸附等温曲线的制作 在具塞锥形瓶中加入相当于干基重1.00g预处理树脂和不同初始浓度的混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液20mL，分别于298.15、318.15、328.15K 下振荡(150r/min)6h，HPLC 分析吸附残液组成。以RA或S的平衡浓度(Ce)为横坐标，单位质量树脂对RA或S的平衡吸附量(qe)为纵坐标，绘制吸附等温曲线。

1.2.6 温度和吸附液初始浓度对吸附选择性的影响

通过对同一场景进行取景后，通过摄像机标定获得的内、外参数对两个图像进行矫正、获得视差，进而得到物体在三维空间中的坐标以及摄像头与物体之间的距离。在确定前方障碍物前，预先设定无人机的安全距离L以及一个标准的点数N，在计算每一个匹配点到摄像机的距离后，会得到n个距离大于L的匹配点，如果n>N,则可视为无人前方有障碍物，于是无人机可以在横向平面的任意方向水平运动，直到n

取相当于干基重1.00g预处理树脂，加入20mL混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液(初始浓度分别为3、4、5、7.5g/L)，分别考察 298.15、318.15、328.15K 时树脂的吸附选择性，待吸附平衡后取样进行HPLC分析。1.2.7 吸附液pH对吸附选择性的影响 取相当于干基重1.00g预处理树脂，加入20mL浓度为5g/L的混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液，在298.15K下考察吸附液 pH(2、3、4.4、5、5.3、6.4、7、8.7、11.6、12.7)对吸附选择性的影响，待吸附平衡后取样进行HPLC分析，按式(3)计算吸附率。

1.2.8 溶剂对吸附选择性的影响 预处理树脂于105℃烘箱中干燥，准确称取1.00g。分别采用去离子水、乙酸乙酯-二甲亚砜(90/10，v/v)、乙腈-水(75/25和90/10，v/v)、乙醇-水(90/10，v/v)等溶剂溶解混合糖苷(RA/S=1∶1)，配制浓度为5g/L的吸附液，在298.15K下考察溶剂对吸附选择性的影响。1.2.9 分离实验 称取相当于干基重1.00g预处理树脂，加入20mL浓度为5g/L的甜菊糖苷水溶液(pH7.0，RA含量分别为25%和70.3%)，在298.15K下静态吸附6h，计算静态吸附率、吸附残液中RA/S比值，以及RA在吸附残液中的保留率。

2 结果与讨论

2.1 树脂的吸附选择性

筛选树脂时，为了保证吸附残液中一定的溶质浓度，D380、D201、D296、D392 采用初始浓度为 5g/L 的吸附液，D303、D301-T、D301-G、D301-R 采用初始浓度为3.5g/L 的吸附液，D315、D301、D890、335、717、HZ-9采用初始浓度为2g/L的吸附液，结果见表1。

由表1可知，带伯氨基 D392和带叔氨基的D301-G吸附选择性较好，残液中RA/S分别为2.247和1.608。树脂对S和RA的吸附主要依靠疏水相互作用，S的疏水性比RA的强，树脂较多地吸附S，从而表现出吸附选择性。树脂极性对吸附性能有重要影响。伯氨基和叔氨基为极性基团，改变了树脂表面的极性，它们还与溶质分子的羟基形成氢键［15］，使得吸附选择性增加。陈天红等［10］向非极性大孔吸附树脂骨架引入酮基，提高了树脂的吸附选择性，酮基含量为0.96mmol/g时，树脂对S和RA的吸附率分别为87.3%和81.9%，吸附残液中RA/S为1.02(初始值为0.72)。陈天红等［11］的研究发现，引入吡啶基也可以提高树脂的吸附选择性。当吡啶基含量为0.29mmol/g时效果最好，吸附残液中RA/S可达0.84(初始值为0.67)。施荣富等［16］的研究表明，带季氨基的强极性吸附树脂ADS-7对RA具有一定的吸附选择性。本研究同样表明带季氨基的D296、D201、D890和717树脂对RA具有吸附选择性(见表1)。需要说明的是，树脂的吸附选择性是功能基和树脂骨架结构共同发挥作用的结果［10-11］，如含有多种类型氨基的335、HZ-9树脂和带叔氨基的D301、D315对S和RA的吸附力较弱，几乎不具有吸附选择性。D392吸附选择性最好，而且吸附力较强，解吸相对容易，使用20%乙醇就能很好地解吸，因此选择D392作进一步研究。

表1 树脂的吸附选择性Table 1 The adsorption selectivity of selected resins

2.2 吸附动力学曲线

由图1可知，在吸附初始阶段(0～1h)，树脂对溶质分子的吸附速率较快，RA和S穿过液膜到达树脂外表面;1h后，吸附速率明显减慢，此时树脂表层吸附接近饱和，溶质分子由树脂表层向树脂孔隙内部扩散，扩散阻力不断增加;4h后，溶质分子主要在树脂内表面吸附，吸附逐渐趋于平衡。此外，D392对S的吸附能力大于对RA的吸附能力。

2.3 大孔树脂D392吸附等温曲线

由图2～图3可知，D392对S和RA的吸附量随着温度升高而降低，说明吸附过程为放热过程，温度升高不利于吸附;另一方面，温度升高会增加S和RA在水相中的溶解性，使得被吸附的溶质减少［10］。

对各温度下的qe～Ce进行线性回归分析，可求出树脂对S和RA的分配系数:

式中，q为平衡吸附量(mg/g干基树脂)，C为吸附平衡时溶质浓度(g/L)，K为分配系数(L/kg)。

各温度下树脂对S和RA的分配系数见表2。由表2可知，在供试液浓度范围内，树脂对S的分配系数显著大于RA的分配系数。

图1 大孔树脂D392吸附动力学曲线Fig.1 Adsorption kinetics curves on D392 macroporous resin

图2 大孔树脂D392对S的吸附等温曲线Fig.2 Adsorption isotherm of S on D392 macroporous resin

图3 大孔树脂D392对RA的吸附等温曲线Fig.3 Adsorption isotherm of RAon D392 macroporous resin

表2 各温度下S和RA的分配系数K(L/kg)Table 2 Distribution coefficients，for S and RA at different temperatures

为了描述不同温度条件下D392对S和RA的吸附选择性，定义选择性因数(αj/i)为S的分配系数(Kj)和RA的分配系数(Ki)之比:

由表3可知，298.15K时，D392的选择性因数最大，随着温度升高，树脂对S和RA的吸附选择性减弱。

表3 各温度下树脂对S、RA的选择性因数(αj/i)Table 3 Selectivity values(αj/i)for S and RA at different temperatures

2.4 温度和吸附液初始浓度对吸附选择性的影响

由图4可知，在298.15K，混合糖苷(RA/S=1∶1)水溶液浓度为5g/L时，残液中RA/S比值达到最大值，这时D392对RA和S的吸附选择性最大;随着温度升高，D392对RA和S的吸附选择性减弱。此外，由于树脂对不同浓度溶质的平衡吸附量不同，吸附液初始浓度对吸附选择性有影响，当吸附液初始浓度为5g/L时，D392对RA和S的吸附选择性较好。

图4 温度和吸附液初始浓度对大孔树脂D392吸附选择性的影响Fig.4 Influence of temperature and concentration of adsorption solution on adsorption selectivity

2.5 pH对吸附选择性的影响

由图5可知，pH影响D392对S和RA的总吸附量。在酸性水溶液中，总吸附量较小。因为pH较低时，树脂骨架上的氨基被解离，氨基与S和RA分子上的羟基之间的氢键被破坏，同时铵根离子的水合提高了树脂表面的极性，使得总吸附量较小;当pH逐渐升高时，氨基解离程度减弱，氨基同S和RA分子上的羟基之间的氢键作用增强，当pH＞9时，氨基几乎全部游离，除了氢键作用外，树脂表面的疏水性增强也使其对S和RA的吸附量增加。

结果还表明，pH影响D392对S和RA的吸附选择性。在中性条件下(pH7.0)，残液的RA/S较大，在酸性和碱性条件下则较小。树脂的吸附选择性是由树脂的微孔结构、孔径尺寸、表面极性以及与S、RA分子产生相互作用的功能基团共同促成的［10］。RA比S多一个葡萄糖基，使得RA的极性大于S的极性。在酸性水溶液中，由于氨基被解离，氢键作用受到抑制，在碱性水溶液中，树脂表面的疏水性增强，这都减弱了树脂的吸附选择性。

图5 pH对大孔树脂D392吸附选择性的影响Fig.5 Influence of pH value of adsorption solution on adsorption selectivity

2.6 溶剂对吸附选择性的影响

由图6可知，溶剂对D392吸附选择性的影响显著。在水相中，残液RA/S＞1，树脂对S的吸附能力大于对RA的吸附能力。在乙醇-水(90/10，v/v)中，吸附选择性明显减弱，因为乙醇降低了溶剂极性，溶质与树脂的疏水作用和氢键作用均被抑制［17］。在乙腈-水(75/25，v/v)中，吸附选择性变得不明显，乙腈降低了溶质分子疏水区与树脂表面的疏水作用，对水分子的排斥减弱，进而水分子破坏了氨基与溶质的氢键作用。在乙腈-水(90/10，v/v)中，树脂对S的吸附量小于对RA的吸附量，这是由于乙腈使溶剂极性显著降低，导致极性相对较强的RA更多地分配在固定相中。以乙酸乙酯-二甲亚砜(90/10，v/v)为溶剂，由于二甲亚砜能与溶质分子的羟基形成氢键，同时二甲亚砜的负电性与树脂氨基的正电性的静电吸引作用，使得溶质分子的羟基与树脂氨基的氢键遭到破坏，因而吸附选择性微弱。以上结果表明，D392的吸附选择性是疏水吸附和氢键吸附协同作用的结果。

图6 溶剂对大孔树脂D392吸附选择性的影响Fig.6 Influence of solvents on adsorption selectivity

2.7 大孔树脂D392对RA的富集

将RA含量分别为25%和70.3%的两种实际样品配制成浓度为5g/L的供试液(pH7.0)，采用D392在298.15K静态吸附6h。RA含量为25%的样品(RA/S=0.41)，经选择性吸附，吸附残液中RA含量提高到40%;RA含量为70.3%的样品(RA/S=3.97)，经D392吸附，吸附残液的RA/S=8.58，RA含量提高到88.4%，RA保留率为68.0%。胡静等［12］以含72%RA的糖液(初始RA/S=4.09)为供试液发现大孔树脂D107和D108能较多地吸附S，使得流出液中RA含量增加。本工作的研究结果表明，对于低RA含量的产品，经D392吸附可起到富集RA的效果，对于高RA含量的产品，则可对RA进行纯化。

3 结论

大孔树脂D392在水溶液中对RA和S具有较好的吸附选择性，在乙酸乙酯-二甲亚砜(90/10，v/v)、乙醇-水(90/10，v/v)、乙腈-水(75/25，v/v)等溶剂中，吸附选择性变得不明显。同时，D392具有良好的解吸性能，使用20%乙醇就能很好地解吸。在水溶液中，D392对S和RA的吸附为放热过程，且随温度升高吸附选择性降低。供试液pH和浓度对吸附选择性有影响，含 RA70.3%的实际样品(pH7.0、5g/L)经D392吸附处理，吸附残液中RA含量可提高到88.4%，RA保留率为68.0%。

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