瑶药定心藤挥发油的提取工艺及其GC-MS分析

曾 立， 向 荣， 尹文清， 欧阳恩鸿， 曾 燕

(1.邵阳医学高等专科学校药学系，湖南邵阳 422000;2.广西师范大学药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，广西桂林 541004)

定心藤Mappianthus iodoies系茶茱萸科Icacinaceae定心藤属Mappianthus植物，为瑶医常用药材“十八钻”之一［1］。瑶医认为“钻”类药物性能强劲钻透、通达经络、透利关节，多为行气止痛、散瘀消肿药，是瑶族传统治癌“打药”［2］。因此，瑶医常用其藤茎来除湿、消肿和消炎，还用来治疗毒蛇咬伤及黄疸。作者曾对定心藤中化学成分进行研究［1］，不曾得到确切的相对应活性物质，而定心藤中挥发油的提取和组分分析，国内外还尚未见报道。

通常挥发油一般具有驱风和局部刺激作用，另外还有广泛的生物活性，临床上主要用于止咳、平喘、祛痰、发汗、解表、镇痛及抗菌消炎等功效［3］。这些都与定心藤的临床应用很相似，为了进一步深入认识定心藤的内在化学成分，本研究拟通过正交试验探讨定心藤中挥发油超临界CO2的最佳提取工艺条件，并采用GC/MS联用技术对挥发油中化学成分进行定性分析，采用峰面积归一化法计算各成分相对含有量。该实验结果为瑶族医药定心藤的进一步开发研究提供科学依据。

1 材料和仪器

石油醚 (60～90℃)，苯，KOH，甲醇 (以上试剂均为分析纯级，广东汕头市西陇化工厂);所用水为二次蒸馏水;CO2为食品级 (≥99%);定心藤购自邵阳市中心大药房，经由杨林老师鉴定为茶茱萸科定心藤属植物定心藤Mappianthus iodoies，标本存放于邵阳医学高等专科学校药学系植物标本室。

HA 130-50-01型超临界萃取装置 (江苏南通华安科研仪器有限公司);Agilent6890-5973气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);JA1003N型电子天平 (上海江岳电子科技有限公司);JB/T5520-91型电热恒温干燥箱 (上海跃进医疗器械厂)。

2 方法

2.1 挥发油的提取［4］准确称取粉碎后的定心藤干燥藤茎350 g装入料筒，放入萃取釜内，打开冷循环制冷气阀，设置萃取釜分离Ⅰ、分离Ⅱ的温度，当制冷设备停止工作时，打开高压泵，并打开相应阀门保持通路状态，通过流量计调节CO2的流量;保持恒温恒压循环并维持适当时间，萃取完毕，打开分离釜排料阀，收集提取物。

2.2 正交试验设计 参阅相关资料，以定心藤挥发油的收率为考察指标，选用萃取压力 (A)、萃取温度 (B)、萃取时间 (C)和CO2流量 (D)4个因素3个水平进行正交试验［5］(见表1)，每个试验号平行做3次实验，得出定心藤挥发性成分的最佳提取工艺条件。

表1 因素水平

2.3 脂肪酸甲酯制备 采用酯交换法［6］:称取20 mg萃取物，置入10 mL试管中，加石油醚-苯 (1∶1)溶液2 mL，振荡溶解，再加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液2.0 mL，剧烈振荡1 min，放入60℃水浴锅静置，试管取出后再加入水至刻度，取上层清液进行测定。

2.4 GC/MS测定条件［7］气相色谱条件:Agilent6890-5973气相色谱-质谱联用仪，HP-5msi毛细管色谱柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm);进样口温度250℃;升温程序:设置初温40℃保持4 min，以6℃/min速度升温到200℃保持5 min，以8℃/min速度升温到260℃保持20 min;载气为99.999%高纯氦气，体积流量1 μL/min，进样量1 μL，不分流进样 。

质谱条件:EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，柱前压9.8 psi(1 psi=6.895 kPa)，扫描质量范围(m/z):35～550。

3 结果与讨论

3.1 定心藤超临界CO2萃取正交试验结果 根据表2的L9(34)正交试验分析可知，影响超临界CO2流体萃取定心藤挥发性成分的主次因素为:A＞D＞C＞B。B因素为不显著因素，综合分析，超临界CO2流体萃取定心藤中挥发性成分的最佳工艺为:A3B2C3D3，即萃取压力45 MPa，萃取温度40℃，萃取时间4 h，萃取体积流量30 L/h，在此条件下挥发性成分的3次平均收率能达到1.217%。

表2 L9(34)正交试验结果

3.2 气质联用结果 利用气相色谱-质谱联机联用法对定心藤超临界CO2萃取物进行分离和结构鉴定。对总离子图中的各色谱峰对应的质谱图经联用仪的计算机N ISTO5谱库进行定性检测，从定心藤挥发油中分离出85个峰。依据相似度的概率 (本研究只讨论匹配度大于90%的物质)，结合人工谱图解析，并查阅相关的文献［8］，确认了32种化合物，结果见表3。各组分的相对质量分数是根据总离子流图由计算机采用峰面积归一化法计算而得。

从表3可知，超临界CO2萃取所得定心藤挥发油中主要是脂肪烃、酯类、脂肪酸等类型化合物，已鉴定成分占挥发性成分总量的55.04%，其中质量分数最高的组分是棕榈酸甲酯，亚油酸甲酯，油酸甲酯，角鲨烯等。

3.3 讨论

本实验采用超临界CO2萃取法具有环境友好、操作温度低、有效成分不易破坏等优点。在萃取过程中排除了一些化学成分遇氧易氧化或见光反应的可能性，能真实、全面地反映定心藤中挥发性化学组分。

表3 定心藤中挥发油中化学成分

医学研究表明，不饱和脂肪酸对人体具有重要的平衡调节作用，是不可缺少的物质，在降血脂、抗肿瘤、营养和免疫调节等方面起重要作用［9］。其中棕榈酸与降低血清胆固醇、抑制血小板聚集的药理作用是密切相关的［10］;而亚油酸具有防癌抗癌、增强机体免疫能力、降低胆固醇和逆转动脉粥样硬化的作用［11］。角鲨烯［12］是一种重要的生物活性物质，具有抗肿瘤、抗疲劳、抗心血管疾病等功效。

瑶药是中华民族特色医药的重要组成部分。由于各种原因，目前对于瑶医药的研究还局限于较低水平。本研究结果显示，定心藤超临界CO2提取挥发油中具有抗肿瘤活性成分，而在本研究的后续研究中，我们发现定心藤超临界CO2提取挥发油具有清除自由基的功能［13］，这些研究结果为定心藤做为瑶族传统治癌“打药”［14］提供了一定的科学依据，但仍有许多问题需要进一步研究。比如定心藤其中的活性物质是否是角鲨烯、棕榈酸、亚油酸其中之一或者是协同作用有待进一步的药理实验研究。

［1］曾 立，尹文清.定心藤中酚性成分的研究［J］.中华中医药杂志，2011，26(4):838-840.

［2］戴 斌，李钊东，邱翠嫦，等.“虎牛钻风”类传统瑶药的调查研究［J］.中国民族民间医药杂志，1998，31(2):28-31.

［3］吴立军.全天然药物化学［M］.4版.北京:人民卫生出版社，2004:258.

［4］段少卿.钩藤化学成分及抗氧化活性研究［D］.桂林:广西师范大学，2010:42.

［5］卢远倩，杨政芳，骆焱平.超临界二氧化碳萃取九里香精油的工艺条件研究［J］.时珍国医国药，2011，22(1):35-36.

［6］韩 娜，赵建邦，宋平顺.莱菔子脂溶性成分的GC-MS分析［J］.中国现代应用药学，2011，28(1):74-76.

［7］李 叶，尹文清，段少卿.瓜馥木挥发油GC—MS分析［J］.粮食与油脂，2010(6):17-19.

［8］丛浦珠.天然有机质谱学［M］.北京:中国医药科技出版社，2008.

［9］于双慧，陈晓辉，毕开顺.GC法测定荜澄茄中棕榈酸、油酸与亚油酸的含量［J］.药物分析杂志，2008，28(9):1485-1488.

［10］苏艳红，陈晓春，白珂珂，等.伏康树籽挥发油的GC-MS分析［J］.药物分析杂志，2011，31(3):496-498.

［11］纳 智.滇南红厚壳种子油的脂肪酸成分［J］.热带亚热带植物学报，2005，13(6):505-506.

［12］官 波，郑文诚.角鲨烯提取、纯化及其应用［J］.粮食与油脂，2010(2):44-46.

［13］曾 立，尹文清，朱 琪，等.定心藤挥发油抗氧化活性研究［J］.广东农业科学，2011，38(18):80-83.

［14］庞声航，余胜民，黄琳芸，等.广西20种传统瑶药抗肿瘤筛选研究［J］.广西中医药，2006，29(4):53-57.