HPLC-UV-MS法同时测定痹祺胶囊中7个有效成分

经雅昆， 江振作， 刘亚男， 王跃飞

(天津市中药化学与分析重点实验室，天津中医药大学，天津300193)

痹祺胶囊源于汉代名医华佗的传世验方“一粒仙丹”，1983年天津达仁堂制药二厂在该秘方的基础上结合现代科技重新组方，研制出抗风除湿新药——痹祺胶囊。痹祺胶囊是由马钱子、川芎、甘草、丹参、白术、三七、党参等十味中药组成的复方制剂，具有益气养血，祛风除湿，活血止痛之功效，临床用于气血不足，风湿阻滞，肌肉关节酸痛，关节僵硬变形等风湿、类风湿性关节炎、肩周炎、颈椎病、腰椎间盘突出症等疾病［1］。方中马钱子苦寒，具有散结消肿，通络止痛之功［2］，士的宁和马钱子碱是其主要有效成分;丹参活血化瘀、通络止痛［3-6］，主要成分为丹酚酸B、丹参酮ⅡA和隐丹参酮;甘草调和诸药［7］，甘草苷和甘草酸为其主要成分。目前，大多数文献主要围绕痹祺胶囊的药理、毒理作用和临床应用开展研究工作［8］，痹祺胶囊质量控制方面的研究文献报道较少，主要以痹祺胶囊中士的宁、马钱子碱和丹酚酸B为检测指标开展质量控制研究［9-10］。本研究在此基础上建立了一种同时测定痹祺胶囊中士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA7个活性成分含有量的方法，能够更全面地评价痹祺胶囊的质量。

1 仪器与试剂

Finnigan LCQ Deca XPplus质谱仪 (美国 Finnigan公司)，Agilent 1100型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)，由二极管阵列检测器 (DAD)、柱温箱、四元梯度泵、自动进样器、在线真空脱气机组成，Agilent ChemStation数据处理系统;BP121S万分之一天平 (德国塞多利斯公司);METTLER TOLEDO AX205(瑞士)十万分之一天平;KQ—250E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);2—16A高速离心机 (美国Tomos公司)。

对照品士的宁 (批号:110705-200306)、马钱子碱 (批号:110706-200505)、甘草苷 (批号:111610-201005)、丹 酚 酸 B(批 号:111562-200908)、隐丹参酮 (批号:110852-200305)和丹参酮ⅡA(批号:110766-200619)均购于中国食品药品检定研究院，甘草酸购自天津中新药业研究中心，藁本内酯购自天津马克生物技术有限公司，纯度≥98%。

7个批次的痹祺胶囊由天津达仁堂京万红药业有限公司提供。

甲醇和乙腈 (色谱纯，MEREK);甲酸 (色谱纯，TEDIA);Millipore超纯水。

2 方法与结果

2.1 液相色谱、质谱条件 Agilent Zorbax C18色谱柱 (4.6 mm×100 mm，1.8 μm);以乙腈 (A)-0.1%甲酸水溶液 (B)为流动相，梯度洗脱 (0～50 min，7% ～85%A);体积流量0.5 mL/min;检测波长为260 nm(0～16 min)，286 nm(16.01～23 min，250 nm(23.01 ～28min)，278nm(28.01～40 min)，270 nm(40.01～50 min);柱温40℃;进样量5 μL。

离子检测模式为0～14 min:正离子检测模式;14～28 min:负离子检测模式;28～50 min:正离子检测模式;ESI喷雾电压 ±4.5 kV;鞘气 (N2)压力为276kPa;辅助气 (N2)体积流量3.3 L/min;毛细管温度350℃;毛细管电压 ±19 V;扫描范围m/z100～850 amu。

2.2 对照品贮备液的制备 精密称取士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本内酯、隐丹参酮和丹参酮ⅡA对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本内酯、隐丹参酮和丹参酮ⅡA分别为 0.84、1.10、0.68、1.01、1.02、1.06、1.26、1.00 mg的对照品贮备液，于4℃保存。

2.3 供试品溶液的制备 取痹祺胶囊粉末0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，放至室温后，再次称质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液即得供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备 取痹祺胶囊中除马钱子、川芎、丹参和甘草以外的其他药材，按处方剂量及制法和工艺要求制备缺马钱子、川芎、丹参和甘草的阴性样品，按供试品溶液的制备方法，制得阴性样品溶液。

2.5 化合物的定性分析 在优化的色谱和质谱条件下，取痹祺胶囊的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样分析，得到痹祺胶囊8个成分混合对照品色谱图 (图1-A)、供试品色谱图 (图1-B)、阴性样品色谱图 (图1-C)及痹祺胶囊供试品的质谱总离子流 (TIC)图 (图1-D)。由图1-C可知阴性样品对士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的测定无干扰，对藁本内酯 (图1中峰a)的测定有干扰，舍去藁本内酯。由图1-B可知，供试品中被测成分与相邻组分的分离度R＞1.5，达到基线分离。通过比较痹祺胶囊供试品和对照品的色谱保留时间(tR)和ESI(+/-)MS数据，确定色谱峰1～7分别为士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA。7个化合物的质谱信息见表1。

图1 对照品 (A)、供试品 (B)、阴性样品 (C)HPLC色谱图及供试品 (D)TIC图Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)，negative sample(C)and total ion-current chromatogram of sample(D)

表1 痹祺胶囊样品中7个化学成分的ESI(+/－)MS数据Tab.1 Data of ESI(+/－)MS of seven components in Biqi Capsules

2.6 线性关系、定量限、检测限试验 分别准确移取2.2项各对照品贮备液适量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀释得士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA质量浓度分别为 61.48、32.93、113.1、228.5、271.4、3.353、6.653 μg/mL 的混合对照品溶液，并逐级稀释成一系列不同质量浓度的对照品溶液，进样5 μL测定。以对照品质量浓度X(μg/mL)对峰面积Y进行线性回归。以信噪比3∶1为检测限，以信噪比10∶1为定量限，按2.1项所述色谱条件进样分析。结果见表2，7个化合物在各自的质量浓度范围内线性关系良好。

表2 7个化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of seven components in Biqi Capsules

2.7 精密度试验 按2.3项下方法制备供试品溶液，2.1项所述色谱条件连续进样6次测定，连续进样3 d，记录士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的峰面积，计算7个成分的日内精密度和日间精密度，结果见表3。表明精密度良好。

表3 7个化合物的日内精密度 (n=6)和日间精密度 (n=3)Tab.3 RSD values of intra-day and inter-day precision of seven components

2.8 稳定性试验 按2.3项下方法制备供试品溶液，2.1项所述色谱条件分别于0、3、6、9、12 h进样5 μL测定，考察供试品溶液的稳定性。士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为0.37%、0.57%、 0.46%、 0.36%、 0.30%、 1.66%、0.80%。结果表明供试品溶液室温放置12 h基本稳定。

2.9 重复性试验 按2.3项下方法制备供试品溶液，平行处理6份，在2.1项所述色谱条件下每份连续进样2次测定，记录士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的峰面积，计算质量分数分别为0.756 2、0.514 8、1.190、2.671、3.694、0.041 9、0.086 9 mg/g;RSD值分别为2.04%、1.86%、0.87%、1.00%、0.81%、2.14%、1.26%。表明本方法重复性好。

2.10 加样回收率试验 取痹祺胶囊药粉0.25 g，精密称定，共6份，准确加入与样品中含有量相当的士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA对照品贮备液，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项所述色谱条件分别每份连续进样2次测定，计算加样回收率，结果见表4。

表4 7个化合物加样回收率试验结果 (n=6)Tab.4 Average recoveries of seven components(n=6)

2.11 样品测定 另取7个批次的痹祺胶囊。按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定。计算痹祺胶囊中7个化学成分的质量分数，结果见表5。结果表明:痹祺胶囊中有毒成分士的宁和马钱子碱在制剂中的质量分数比较稳定;丹酚酸B和甘草酸的质量分数相对较高，隐丹参酮和丹参酮ⅡA质量分数相对偏低。

表5 痹祺胶囊中7个化学成分测定结果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

表5 痹祺胶囊中7个化学成分测定结果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

批次 士的宁/(mg·g-1)马钱子碱/(mg·g-1)甘草苷/(mg·g-1)丹酚酸B/(mg·g-1)甘草酸/(mg·g-1)隐丹参酮/(mg·g-1)丹参酮ⅡA/(mg·g-1)1 0.890±0.040 0.569±0.004 0.771±0.060 4.435±0.123 1.786±0.033 0.038±0.001 0.110±0.004 2 0.840±0.040 0.546±0.001 0.693±0.001 2.446±0.016 3.300±0.022 0.247±0.001 0.354±0.002 3 0.790±0.040 0.593±0.006 0.753±0.007 2.982±0.011 3.477±0.008 0.224±0.001 0.317±0.001 4 0.881±0.040 0.566±0.003 0.723±0.003 2.884±0.012 3.344±0.008 0.260±0.002 0.355±0.001 5 0.870±0.040 0.559±0.007 0.744±0.003 2.977±0.026 3.466±0.032 0.259±0.001 0.357±0.001 6 0.819±0.040 0.525±0.012 1.004±0.012 3.188±0.030 2.414±0.037 0.226±0.003 0.320±0.003 7 0.840±0.040 0.541±0.003 0.986±0.001 3.116±0.008 2.438±0.007 0.225±0.001 0.317±0.001 RSD/% 4.32 3.98 15.82 19.58 23.22 37.00 28.81

3 讨论

3.1 提取条件的选择 采用单因素循环的方法，分别考察了提取溶剂 (50%、75%、100%甲醇)、提取溶剂倍数 (50倍、100倍、200倍)、提取时间 (10、20、30、60 min)的提取效率。综合考虑提取效率和溶剂用量，选择50倍量75%甲醇超声提取30 min。

3.2 检测指标的选择 马钱子在处方中起着重要作用，具有通络止痛、散结消肿的功效。士的宁和马钱子碱既是其中主要有效成分，也是有毒成分［11-12］，因此士的宁和马钱子碱是痹祺胶囊质量控制的关键指标。丹参活血化瘀、通络止痛，主要成分为丹酚酸B、丹参酮ⅡA和隐丹参酮;甘草调和诸药，甘草苷和甘草酸为其主要成分。综上所述，本实验选取士的宁、马钱子碱、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隐丹参酮和丹参酮ⅡA作为检测指标，能更全面反映痹祺胶囊的质量，保证临床用药的安全性和有效性。

3.3 检测波长的选择 由于本实验选取的7个检测指标的最大吸收波长不同，因此为了达到检测灵敏度高、干扰小且真实反映痹祺胶囊各个有效成分含有量的目的，采用波长切换的方法。结合各化合物的最大吸收波长和出峰时间，利用二级阵列管检测器波长切换的功能，确定了检测波长。

3.4 质谱离子模式的选择 由于本实验选取的7个检测指标在正、负离子模式的响应不同:士的宁、马钱子碱、甘草苷、隐丹参酮和丹参酮ⅡA在正离子检测模式下响应高;丹酚酸B、甘草酸在负离子检测模式下响应高，最终确定离子检测模式为0～14 min:正离子检测模式;14～28 min:负离子检测模式;28～50 min:正离子检测模式。

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