鳕鱼皮胶原活性多肽的制备研究

刘春娥，刘峰，刘苏瑶，杨烨

（中国农业大学烟台研究院，山东烟台 264670）

胶原蛋白广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿中，是结缔组织极其主要的结构蛋白，起着支持结构器官、保护机体的作用。由于胶原蛋白的独特结构，使其具有稳定的性质，难以分解，因此很难被人体吸收，食用效率低[1-2]。现代研究表明，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100%[3]。目前，蛋白水解的方式通常采用酶解法，相对于化学法其反应条件温和，反应时间短，产品营养价值高，易于人体消化吸收[4-6]。能用于蛋白酶解的酶类种类较多，不同的酶类酶解效果不同，水解得到的产物活性也不相同。

以鳕鱼皮为试验对象，研究4种不同蛋白酶在最适作用条件下的酶解效果，进而对4种酶解液的抗氧化效果进行对比研究。

1 材料与方法

1.1 材料

鳕鱼皮由山东东方海洋科技股份有限公司提供。

1.2 仪器和试剂

UV1901紫外可见分光光度计：上海凤凰化学仪器；pH计：上海精密仪器；中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶：上海蓝季科技发展有限公司；总抗氧化力试剂盒、清除超氧阴离子自由基试剂盒：南京建成生物工程公司；其他试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制备[7]

鱼皮自然解冻后，称取一定量的鱼皮放置于烧杯中，将约200 mL 0.5%的NaOH倒入烧杯中，没过鱼皮，浸泡0.5 h后，反复水洗至中性。再加入约200 mL 0.5%的H2SO4浸泡0.5 h，水洗至中性，加入一定量的蒸馏水，将鱼皮剪碎。

用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl调节pH，加入一定量的酶，恒温水解，搅拌，反应至设定时间。水解结束后，将水解液置于90℃的水浴内灭活10 min，然后自然冷却。

1.3.2 酶解正交优化试验设计

对4种蛋白酶分别考察不同的pH、酶解温度、加酶量和酶解时间对酶解效果的影响，以水解度（Degree of Hydrolysis，DH）为考察指标。

1.3.3 水解度测定[8]

水解度测定采用茚三铜比色法。

1.3.4 抗氧化能力测定

采用试剂盒法。

2 结果与分析

2.1 4种酶正交试验结果

对4种蛋白酶在单因素试验的基础上，选择pH、酶解时间、酶解温度和加酶量4个因素，设定3个水平，进行正交试验，试验结果如下。

2.1.1 胰蛋白酶正交试验结果

胰蛋白酶酶解条件正交试验结果，见表1。

表1 胰蛋白酶酶解条件正交试验结果Table 1 The results of orthogonal test of trypsin

由R值可以看出，各因素对酶解鳕鱼皮的影响由强到弱为D＞B＞A＞C，即时间＞温度＞pH＞加酶量。根据影响因素的结果显示采用胰蛋白酶酶解的最佳工艺：加酶量3%、温度50℃、pH6.5、时间6h，此条件下的DH%为15.32%。

2.1.2 中性蛋白酶正交试验结果

中性蛋白酶正交试验结果见表2。

表2 中性蛋白酶酶解条件正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test of neutral protease

续表2 中性蛋白酶酶解条件正交试验结果Continue table 2 The results of orthogonal test of neutral protease

由表2结果可以看出，各因素对酶解鳕鱼皮的影响由强到弱为C＞A＞D＞B，即加酶量＞pH＞时间＞温度。根据影响因素的结果显示采用中性蛋白酶酶解的最佳工艺：加酶量4%、温度 45℃、pH6.5、时间4 h，此条件下的DH%为10.21%。

2.1.3 碱性蛋白酶正交试验结果

碱性蛋白酶正交试验结果见表3。

表3 碱性蛋白酶酶解条件正交试验结果Table 3 The results of orthogonal test of properase

根据表3结果，各因素对酶解鳕鱼皮的影响由强到弱为A＞B＞C＞D，即加pH＞温度＞加酶量＞时间。根据影响因素的结果显示采用碱性蛋白酶酶解的最佳工艺：加酶量4.5%、温度50℃、pH 8.5、时间 5 h，此条件下的DH%为13.87%。

2.1.4 木瓜蛋白酶正交试验结果

木瓜蛋白酶正交试验结果见表4。

表4 木瓜蛋白酶酶解条件正交试验结果Table 4 The results of orthogonal test of papain

续表4 木瓜蛋白酶酶解条件正交试验结果Continue table 4 The results of orthogonal test of papain

由表4可以看出，各因素对酶解鳕鱼皮的影响由强到弱为 D＞C＞A＞B，即时间＞加酶量＞pH＞温度。根据影响因素的结果显示采用木瓜蛋白酶酶解的最佳工艺：加酶量4.5%、温度55℃、pH7、时间5 h，此条件下的DH%为17.19%。

2.2 4种酶解液多肽抗氧化效果测定

按照4种蛋白酶各自最适作用条件水解鳕鱼皮，不同蛋白酶酶解得到的鱼皮胶原多肽的总抗氧化力测定结果见表5，除超氧阴离子自由基的测定结果见表6。

表5 4种酶解液总抗氧化力测定结果Table 5 The results of the total antioxidized ability of four enzyme digestion solution

表6 4种酶解液对超氧阴离子自由基的清除效果Table 6 Scavenging activities of four enzyme digestion solution on O2-

从表5可以看出，碱性蛋白酶酶解液的总抗氧化能力最高，达到2.431 U/mgprot，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的总抗氧化能力接近。从表6可以看出，4种鳕鱼皮酶解液对O2-均有一定程度的清除作用，中性蛋白酶酶解液的清除效果最好。

3 结论与讨论

机体新陈代谢所产生的自由基，是代谢过程中的副产品，包括羟自由基、超氧阴离子自由基、过氧化物等，它们均可造成机体损伤[10]。因此筛选具有清除自由基和抗脂质过氧化的功能因子是目前热门的研究课题。现代科学研究证实，天然蛋白质经水解后所产生的多肽具有免疫调节、降血压、抗氧化等生理调节作用[11]。本实验结果表明鳕鱼皮胶原多肽粗品具有一定的抗氧化能力。不同的酶水解得到的多肽其总抗氧化能力和清除超氧阴离子自由基能力并不一致。在本实验4种酶中，碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液的抗氧化能力要明显高于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，而木瓜蛋白酶酶解的水解度最高。这一实验结果提示，在多肽提取过程中，不能单纯以水解度这一指标来衡量蛋白酶的优劣。

采用4种不同的蛋白酶对鳕鱼皮进行酶解，制备多肽溶液。结果显示，以水解度为指标，木瓜蛋白酶的酶解效果最好，水解度可以达到17.19%，胰蛋白酶次之，水解度可达到15.32%。4种蛋白酶酶解鳕鱼皮得到的多肽溶液均具有抗氧化能力，能有效地清除超氧阴离子自由基。以总抗氧化力为指标，碱性蛋白酶的酶解液抗氧化力最强，中性蛋白酶酶解液清除超氧阴离子自由基的能力最强。

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