脱脂蛋黄蛋白粉酶水解实验研究

李建颖，赵彦巧，吴子健，詹鸣昕

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）

目前医药企业提取完药用卵磷脂后，就将蛋黄粉下脚料废弃，其实提取完药用卵磷脂后的蛋黄粉还含有一定量的鸡蛋蛋白质。鸡蛋蛋白质是一种优质蛋白，消化率达98%，生物价达94，其氨基酸组成符合人体需要的模式[1]。如何更好地利用蛋黄粉的下脚料，是目前医药产业中一个值得研究的问题。高蛋白粉是一种有特色的产品，其蛋白质含量高达80%以上，脂肪和胆固醇含量较低，长期食用，没有动物蛋白的副作用，不会引起肥胖、高血脂、心脑血管等疾病，具有较高的营养价值，也有较高的经济效益和社会效益[2]。目前，国内外对鸡蛋蛋白多肽的功能特性的研究报道较少。目前针对蛋黄研究产品仅有蛋黄油、卵黄免疫球蛋白、卵黄高磷蛋白，品种较少，还应将蛋黄中其他的蛋白质成分及其多肽进行充分利用[3]。因此，本文对蛋黄蛋白多肽的功能特性进行了研究，可为鸡蛋蛋白多肽在婴幼儿、老年人、病人等蛋白吸收机能较差人群的食品开发中的应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

蛋黄粉：购于北京金健力蛋粉厂；氢氧化钠、浓盐酸、三氯乙酸、甲醛、无水碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、95%乙醇、无水乙醚等试剂：购于天津市江天化工技术有限公司，皆为分析纯；丙酮、硫酸：购于天津市化学试剂批发公司，分析纯；福林试剂B：购于鼎瑞化工（上海）有限公司，分析纯；干酪素、L-酪氨酸：购于天津市光复化工精细研究所；胃蛋白酶、胰蛋白酶：购于中国上海化学试剂有限公司。

PHS-3B型精密pH计、FA1004型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；XMTD-204型数显式电热恒温水浴锅、EMS-2型加热定时磁力搅拌器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚英生化仪器厂；DGG-H-3型电热鼓风干燥箱 ：天津市天宇实验仪器有限公司；UV-7054单光束紫外-可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；DL-6000型低速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；全自动凯氏定氮仪：苏州市天威仪器有限公司。

1.2 脱脂蛋黄蛋白粉的制备

采用乙醇浸取法对蛋黄粉脱脂去油，具体操作方法[4]：称取蛋黄粉加入锥形瓶中，加入15倍量乙醇脱脂，温度40℃，间歇搅拌4 h，过滤，沉淀用少量溶剂洗，抽干，放入干燥箱中干燥，即得。

1.3 蛋白酶解液的制备

称取一定量的蛋白粉，加水匀浆，浓度为5%（质量分数）左右，加1 mol/L氢氧化钠或者1 mol/L盐酸调节体系pH，加入指定重量的酶，置于一定温度的水浴锅中水浴中加热一定时间后，在95℃下灭酶10 min，冷却后，于6 000 r/min下离心15 min，取上清液即得酶解液。取酶解液，用半微量凯氏定氮法[5]测定总氮含量，用电位滴定法[6]测定氨基氮含量。

1.4 水解度的测定

蛋白质的水解度（DH）定义为在水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比，其计算公式如下：

2 结果与讨论

2.1 胃蛋白酶水解蛋白粉最适温度的选择

固定蛋白粉浓度为5%（g/mL，下同），酶浓度为1%，pH 为 2.0，温度分别设为 30、38、40、45、50 ℃，反应4 h，其水解度测定结果见图1。

由图1可以看出，从30℃开始随着温度的升高，酶水解度逐渐增大，到38℃时水解度达到最大，其水解度为16.12%。随着温度继续升高，蛋白质水解度急剧下降，到50℃达到最低。因此，可认为胃蛋白酶的最适温度为38℃。

2.2 胃蛋白酶水解蛋白粉最适pH的选择

固定蛋白粉浓度为5%，酶浓度为1%，温度为38 ℃，分别调节 pH 为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，反应 4 h，其水解度见图2。

由图2可以看出，在pH在1.0时，随着pH的升高，水解度逐渐增大，当pH达到2.0时，水解度达到最大值，其水解度为16.12%。随着pH继续增大，水解度程下降趋势。因此，胃蛋白酶的最佳pH为2.0。

2.3 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳底物浓度选择

固定酶浓度为1%，温度为38℃，pH为2.0，分别配制蛋白粉浓度为2%、3%、4%、5%、6%，反应4 h，其水解度见图3。

由图3可以看出，当底物浓度在2%～3%时，蛋白质水解度随底物浓度的增加而极具增大，当底物浓度在3%～4%与5%～6%时，蛋白质水解度随底物浓度的增加而减小。在底物浓度为5%时，蛋白质水解度达到最大值，其水解度为16.49%。因此，胃蛋白酶酶解的最佳底物浓度为5%。

2.4 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳酶浓度选择

固定蛋白粉浓度为5%，pH为2.0，温度为38℃，酶添加量分别为 0.2%、0.5%、1.0%、2.0%，3.0%，反应4 h，其水解度见图4。

由图4可以看出，随着酶浓度的增加，蛋白质的水解度逐渐增大。当酶浓度增加到1.0%时，蛋白质的水解度随酶浓度的增加变化不大。因此，在工业化生产中，要综合考虑水解度及生产成本之间的关系，为达到高水解度低成本，选用最适胃蛋白酶添加量为1%，其水解度可达15.90%。

2.5 胃蛋白酶水解蛋白粉最佳水解时间的选择

固定蛋白粉浓度为5%，酶浓度为0.2%，温度为38 ℃，pH 为 2.0，在酶解时间为 1、2、3、4、5 h 期间，分别测其水解度，结果见图5。

由图5可以看出，蛋白质的水解度随着水解时间的延长而增大。当水解时间达到4 h时，水解度随着水解时间的增大而变化不大。因此，确定胃蛋白酶的最佳水解时间为4 h，此时胃蛋白酶水解蛋白粉的水解度为16.77%。

2.6 胃蛋白酶水解正交试验

根据单因素试验所得结果可知，温度、底物浓度、酶浓度、酶解时间是影响水解度的主要因素，采用L9（34）的正交试验，找出最佳试验条件。正交试验方案及结果如表1及表2所示。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

由表2可以看出：各因素对蛋白粉水解度影响的主次顺序为A＞B＞C＞D，即温度对蛋白粉的水解度影响最大，其次是底物浓度、酶浓度，酶解时间。根据k值可确定最优水平组合为A2B3C3D2，即最佳水解条件为：水解温度为38℃，底物浓度为5%，酶浓度为2.0%，水解时间为4 h。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

2.7 验证实验

根据以上分析，进行如下验证实验，结果见表3。

表3 验证实验结果Table 3 Results of the confirmatory experiment

可以看出，实验是稳定可靠的。经过验证实验，得到胃蛋白酶水解的最佳工艺条件，其条件为：水解温度为38℃，底物浓度为5%，酶浓度为2.0%，水解时间为4h。此条件下蛋白粉的平均水解度可达15.76%。

2.8 双酶水解蛋白粉

采用两步水解法[7－8]。根据正交试验的优化水解条件，先用胃蛋白酶在优化条件下先将蛋白粉水解至一定程度，测定水解度。再用胰蛋白酶继续将部分水解的蛋白粉水解至不同程度，其他酶解条件为底物浓度6%、酶浓度0.5%、温度55℃、pH为7.5、水解4 h。以考察胃蛋白酶—胰蛋白酶双酶水解对水解效果的影响，其结果如表4所示。

由表4可知，由胃蛋白酶—胰蛋白酶组合酶水解蛋白粉，可以取得良好的水解效果，水解度明显高于胃蛋白酶单酶水解。

表4 双酶水解对水解效果的影响Table 4 The comparison results of double enzyme hydrolysis and single enzyme hydrolysis

3 结论

1）胃蛋白酶水解的最佳工艺条件：称取5 g蛋白粉，加100 mL水匀浆，加1mol/L盐酸调节pH为2.0，加入2 g胃蛋白酶，38℃条件下水解4 h后，95℃下灭酶10 min，此条件下平均水解度为15.76%。

2）胃蛋白酶—胰蛋白酶组合水解最佳工艺条件：在pH为2.0，温度为38℃，底物浓度为6%的条件下，先加入浓度为2.0%的胃蛋白酶水解4 h，而后调节pH为7.5，温度55℃，再加入浓度为0.5%的胰蛋白酶水解4 h，此时水解度高达20.41%。因此，胃蛋白酶—胰蛋白酶组合酶水解蛋白粉的水解效果明显优于胃蛋白酶单酶水解。

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[1]邱宁,马美湖.鸡蛋蛋白质组学研究现状与展望[J].中国家禽,2011,33(2):4－10

[2]沈蓉.蛋白粉－二十一世纪保健品新宠[J].养生大世界,2006(1):58－59

[3]赵利,刘建涛,苏伟,等.鸡蛋中的生物活性蛋白质和肽[J].中国酿造,2008,24(2):27－29

[4]梁洁,杨永通,黄镇辉,等.高蛋白粉制备工艺的研究[J].现代食品科技,2008,24(5):472－473

[5]张玉葵,叶尔太.凯氏定氮(半微量)法测定牛乳中蛋白质含量的方法[J].中国乳业,2005(6):35－36

[6]宁正祥.食品分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998:117－121

[7]Sutheera K,Soottawat B,Hideki K.Antioxidative and ACE inhibitory activities of protein hydrolysates from the muscle of brownstripe red snapper prepared using pyloric caeca and commercial proteases[J].Process biochemistry,2011,46(5):318－327

[8]王芃.胃蛋白酶胰蛋白酶水解酪蛋白的研究[J].食品研究与开发,2010,31(7):143－147