超声波强化提取杜氏盐藻中β-胡萝卜素工艺的研究

周鸣谦，刘云鹤，2，陈宏柱

（1.淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏连云港 222005）

β－胡萝卜素能降低生物体内因自由基诱发的过氧化作用，具有延缓衰老和防止癌变的功能；同时它还是VA的前体，可用做化妆品助剂、食品和饲料添加剂等。杜氏盐藻（Dunaliella salina）具有较强的β－胡萝卜素合成能力，在适宜条件下培养，其β－胡萝卜素积累量最高可达藻体干重的14%[1]，是较具开发潜力的β－胡萝卜素天然资源。β－胡萝卜素的提取以溶剂法为主，用超声波、微波和超临界流体等手段辅助提取以提高得率[2－7]。本文主要对超声波强化提取杜氏盐藻中β－胡萝卜素的方法进行研究，为杜氏盐藻的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

杜氏盐藻粉：购于山东富施特生物技术有限公司，经超临界二氧化碳脱脂处理。

1.1.2 试剂

丙酮、甲醇、石油醚（沸程60℃～90℃）、氯仿，以上试剂均为分析纯；β－胡萝卜素标准品，纯度≥90%。

1.1.3 仪器

SK8210LHC超声波仪：国华电器有限公司；UV745N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有

式中：X为β-胡萝卜素的得率，%；C为在标准曲线上查得的β-胡萝卜素的含量，（μg/mL）；V1为层析时点样体积，mL；V2为从浓缩液中取出0.1 mL后定容的体积，mL；m 为样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 液料比的影响

根据参考文献[2，4]设定 4 个液料比（mL∶g）梯度（2∶1、4∶1、6 ∶1、8∶1），用超声波（功率 300 W）强化90 s后在温度为25℃条件下提取4次，每次提取5 min，合并提取液后测定β-胡萝卜素的含量并计算其得率。

1.2.3.2 超声强化时间的影响

在提取温度为25℃、提取时间为5 min、液料比为 6∶1（mL∶g）的条件下，用超声波（功率 300 W）分别强化30、60、90、120 s，提取4次，合并提取液后测定β-胡萝卜素的含量并计算其得率。

1.2.3.3 提取温度的影响

在液料比为 6∶1（mL∶g），超声波（功率 300 W）强化时间60 s条件下，分别在15、25、35、45℃提取盐藻中β-胡萝卜素5 min，提取4次，合并提取液后测定β-胡萝卜素的含量并计算其得率。

1.2.3.4 提取时间的影响

在液料比6∶1（mL∶g），超声波（功率 300 W）强化时间 60 s，温度 25℃条件下分别提取 3、5、7、9 min，提取4次，合并提取液后测定β-胡萝卜素的含量并计算其得率。限公司；SHB-III循环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂；GF254 200 mm×100 mm薄层层析硅胶板:安徽良臣硅源材料有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盐藻中β-胡萝卜素的提取流程

脱脂后的藻粉→称取适量置于棕色试剂瓶中→加丙酮∶甲醇（7∶2）[3，8]→超声波辅助提取→恒温静置→得第1次浸提液→沉淀加入提取剂再重复提取3次→合并4次提取液→离心20 min，得提取液。

1.2.2 β-胡萝卜素含量的测定

将β-胡萝卜素提取液转移至蒸发皿进行真空干燥，然后用丙酮沿壁将色素洗下收集定容至5 mL，得浓缩液。按照GB12291-1990《水果、蔬菜汁类胡萝卜素含量的测定》[9]的方法测定浓缩液β-胡萝卜素的含量。经测定，β-胡萝卜素标准工作曲线为y=0.071 3x，R2=0.973。β-胡萝卜素的得率按照以下方法计算：

1.2.4 正交试验

采用四因素三水平正交试验设计研究液料比（A）、超声波强化时间（B）、提取温度（C）和提取时间（D）共同作用下对β-胡萝卜素提取率的影响，优化提取工艺条件，因素水平如表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比的影响

液料比的影响结果见图1。

图1 液料比对β-胡萝卜素得率的影响Fig.1 Effects of organic solvent quantity on the extraction of β-Carotene

由图1知，随着液料比的增加，β-胡萝卜素的溶出量也随之增加。液料比从 2∶1（mL∶g）增加至 6∶1（mL∶g），β-胡萝卜素的溶出量有明显增加；而液料比从6∶1（mL∶g）增加至 8∶1（mL∶g），β-胡萝卜素的溶出量增加不明显。这是由于在一定的提取条件下，提取剂体积增加，能溶出的β-胡萝卜素的量也增加，但是当提取剂增加至一定限度时，易溶解的β-胡萝卜素都已溶出，增加就不明显了。

2.1.2 超声强化时间的影响

超声强化时间的影响结果见图2。

图2 超声波强化时间的影响Fig.2 Effects of ultrasound-assisted time on the extraction of β-Carotene

超声波在液体中有分散效应，使液体产生空化作用，从而使液体中的盐藻细胞破碎，促使β－胡萝卜素的溶出。由图2知，超声强化时间为30、60、90 s的组别比未经强化组别高，其中强化60 s的组别效果最好。而当强化时间增至120 s时，由于超声波的热效应而致使提取液的温度升高，破坏了部分β－胡萝卜素，因此β－萝卜素的得率不但没有增加，反而减少。

2.1.3 提取温度的影响

提取温度的影响结果见图3。图3 提取温度的影响

Fig.3 Effects of temperature on the extraction of β-Carotene

β－胡萝卜素化学性质不稳定，加热时易被氧化。从图3可看出，温度从15℃升至25℃时，提取出的β－胡萝卜素的量明显增加。超过25℃时，部分β－胡萝卜素被破坏，提取量明显减少。

2.1.4 提取时间的影响

提取时间的影响结果见图4。

图4 提取时间的影响

Fig.4 Effects of time on the extraction of β-Carotene

从图4可知，β－胡萝卜素的溶出量随着提取时间的延长而增加，3 min至7 min增加明显，但再继续延长提取时间，β－胡萝卜素的溶出量增加缓慢。

2.2 正交试验

正交试验安排及结果见表2。

通过极差R分析可知，四因素对盐藻中β－胡萝卜素提取量的影响程度依次为超声强化时间＞提取时间＞提取温度＞液料比。即在所设水平条件下，超声强化时间对β－胡萝卜素的提取率的影响最为明显，提取时间、提取温度和液料比在一定范围内对β－胡萝卜素的提取量也有一定的影响，其中液料比影响最小。通过对各因素不同水平K值的比较，得出各个因素的最佳组合为 A1B3C1D3，即液料比 6∶1（mL∶g），超声波强化时间70 s，提取温度20℃，提取时间为9 min。

表2 正交试验安排及试验结果Table 2 Arrangement and results in orthogonally designed test

由于A1B3C1D3组合在试验处理中未出现，故进行验证试验，此条件下β－胡萝卜素的得率为4.418%，高于正交试验各处理的β－胡萝卜素得率，此组合即为提取工艺的最优条件。

3 结论

超声强化提取盐藻中β－胡萝卜素受到液料比、超声波强化时间、提取温度和提取时间等因素的影响，在正交试验所设定因素水平下其影响程度依次为超声波强化时间＞提取时间＞提取温度＞液料比，其最优提取工艺条件为，液料比6∶1，超声波强化时间70 s，提取温度20℃，提取时间为9 min，其条件下β－胡萝卜素得率可达4.418%。

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