不同诱变方法对透明质酸产生菌株Sz560的诱变效应

丁勇，石孝勇，张新明

（陕西科技大学生命科学与工程学院，西安陕西 710021）

透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是一种高分子量的线性大分子粘多糖。1934年Meyer和Palmer首先从牛眼玻璃体中分离出透明质酸[1]，它是由β-D-葡萄糖醛酸（G1cUA）和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖（G1cNAc）所构成的双糖单位重复交替连接而成的连锁状高分子物质[2]。透明质酸具有特殊的生理作用、流变学特性和极强的持水保湿能力，广泛应用于医疗、食品、化妆品工业等领域。

透明质酸生产主要有动物组织提取法和微生物发酵法。动物组织原料来源有限，且透明质酸的含量少、组织成分复杂、提取分离困难。而微生物发酵法所需原料简单、产量不受原料的限制、能够生产更高的分子量的透明质酸、由于与菌体分离、提取过程简单，因此发酵法成为透明质酸生产的发展方向。目前微生物发酵法生产透明质酸的工业菌株多来源于链球菌属[3-4]，经过传统的物理和化学诱变方法筛选高产菌株，而诱变方法选择是否得当直接关系到突变株的性状表达。本文利用紫外线、硫酸二乙酯、亚硝基胍处理原始菌株Sz560以期获得无溶血性、高效生产透明质酸的突变体。

1 材料和方法

1.1 菌种

本实验的菌种来源于陕西科技大学生命科学与工程学院保藏的马腺疫链球菌兽疫亚型，实验室保藏号Sz560。

1.2 培养基

血琼脂平板：70 mm血平板，购自华美生物有限公司。

种子培养基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨 15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO41.5，灭菌前调整pH7.0，121℃灭菌20 min，冷却至温度低于50℃，无菌条件下加人1%优级小牛血清。

摇瓶发酵培养基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，灭菌前调整pH7.0，121℃灭菌20 min。

1.3 仪器与设备

Eppendorf centrifuge 5810R（Eppendorf）、J2-Mc 高速冷冻离心机：美国Beckman公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术公司；pHs-ZC型pH计：上海科学仪器厂。

1.4 致死率

以致死率确定诱变剂量，将诱变后的菌悬液与未经诱变的菌悬液经适当稀释分别涂布于种子培养基平板上，前者平板上的菌落数为A，后者平板上的菌落数为B。计算致死率：

1.5 透明质酸分析

Bitter-Muir法[5-6]

1.6 透明质酸分析

乌式黏度计法

1.7 菌种的诱变方法

1.7.1 紫外线诱变处理

15 W紫外诱变过程：紫外灯功率15 W，照射距离39 cm，照射前打开紫外灯预热20 min，将装有菌悬液平皿置于磁力搅拌器上，照射 20、30、40、50、60 s，稀释104～105倍涂布于血平板上，37 ℃避光培养 18 h～32 h。

1.7.2 硫酸二乙酯诱变

取4.5 mL菌悬液加入10%的硫酸二乙酯溶液0.5 mL，混匀放入37℃水浴锅，50 r/min振荡水浴10、20、30、40 min；在 4 ℃，6 000 r/min 条件下离心 10 min，去上清；加入1 mL，2.5%硫代硫酸钠溶液充分混匀，终止诱变反应，离心去上清；取1 mL生理盐水悬浮，稀释倍数104～105涂血平板。

1.7.3 亚硝基胍诱变

取1 mL种子培养液，4℃，6 000 r/min离心10 min，去上清；取1 mL浓度为0.1 g/L的亚硝基胍溶液悬浮，立即放入水浴锅中，50 r/min振荡水浴10、20、30 min；在4℃，6 000 r/min条件下离心10 min，去上清，加入1 mL，0.1 mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液，终止诱变反应，立即4℃，6 000 r/min离心10 min，去上清，重复3次；取1 mL生理盐水悬浮，经37.5℃培养30 min；稀释 103～104倍涂血平板。

2 结果与讨论

2.1 紫外照射的诱变效应

表1为紫外照射时间对致死率的影响，Sz560对紫外照射的耐受性差，照射时间延长，致死率越高，筛选到透明质酸产量提高幅度较大的突变株的几率增加，传代培养发现在致死率高的条件下回复突变率相应增加，照射时间大于80 s，致死率超过99.9%。表2为筛选出透明质酸产量有一定提高的突变株菌落形态特征，主要分为三大类，A类菌落直径小于原始菌株（菌落直径2 mm～4 mm，菌落呈乳白色、灰白色、半透明、血平板培养菌落表面较湿润），其它形态特征与性状接近于原始菌株，B类菌落基本接近原始菌株，C类在普通平板培养下，菌落表面有少量褶皱，血平板培养发现透明圈直径减少，清晰度略有下降。

表1 紫外照射时间与致死率的关系Table 1 Relationship between UV treatment time and the mortality

表2 紫外诱变突变株的菌落形态特征Table 2 Colony morphology of UV mutant

2.2 硫酸二乙酯的诱变效应

表3为硫酸二乙酯水浴处理时间对致死率的影响，前10 min致死率达到63.05%，随水浴时间延长致死率非线性同步上升，增加幅度趋缓。表4为筛选出透明质酸产量大幅提高的突变株菌落形态特征，该类菌落直径仅为原始菌株的30%～50%，菌落呈圆形、表面光滑、挑起有拉丝感、无溶血性透明圈，见图1。

2.3 亚硝基胍的诱变效应

表5为亚硝基胍水浴处理时间对致死率的影响，前10 min致死率达到69.08%，随水浴时间延长致死率非线性同步上升，增加幅度趋缓。表6为筛选出透明质酸产量大幅提高的突变株菌落形态特征，菌落直径、形态差异性较大，菌落呈圆形、表面光滑、挑起有拉丝感、无溶血性透明圈。

表3 DES处理时间与致死率的关系Table 3 Relationship between DES treatment time and the mortality

表4 硫酸二乙酯诱变突变株的菌落形态特征Table 4 Colony morphology of DES mutant

表5 亚硝基胍处理时间与致死率的关系Table 5 Relationship between NTG treatment time and the mortality

2.4 透明质酸生产菌复筛

3种诱变方法得到的生产性状最好的突变菌株与原始菌株对比，由表7可知，NTG诱变得到的突变株透明质酸产量和相对分子量提高幅度大，因而确定NTG为高产透明质酸生产菌的右边手段。

表6 亚硝基胍诱变突变株的菌落形态特征Table 6 Colony morphology of NTG mutant

表7 突变株复筛结果Table 7 Result of mutant re-screening

2.5 遗传稳定性试验

紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、亚硝基胍诱变得到的各一支产量表达提高的突变菌株进行了传代试验，结果如图3所示。亚硝基胍诱变的突变株产量高、遗传稳定性好，五代培养后产量下降幅度小于10%，生物量下降幅度小于15%。亚硝基胍诱变得到的突变株所做的遗传稳定性实验，由图4可知，随着传代次数的增加，透明质酸分子量与产量下降，在第六代透明质酸的产量与分子量下降幅度大，因此生产条件下五代以后要重新活化培养。

2.5 诱变方法对比

诱变菌株均采用对数生长期，代谢旺盛，生物活性高，易变异[7]。紫外线诱变使DNA分子形成嘧啶二聚体使双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对、引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失产生突变株，紫外诱变致死效果明显，突变体类型较多，正突变率远小于负突变率，回复突变率也很高，遗传性状不稳定，单一使用效果差。硫酸二乙酯和亚硝基胍属于烷基化试剂，使碱基许多位置上增加了烷基引起DNA分子错配从而获得突变株，硫酸二乙酯主要引起点突变，而亚硝基胍可作用于复制叉附近，引起多重突变株出现，因此出现菌落形态特征明显不同的突变株。

3 结论

诱变育种是工业微生物育种的重要手段，本次试验考察了紫外诱变、硫酸二乙酯、亚硝基胍3种诱变剂对透明质酸产生菌马腺疫链球菌兽疫亚型（Streptococcus zooepidemicus）Sz560进行诱变处理，通过传代、发酵等试验验证诱变效果，对比得出：

1）3种诱变方法对透明质酸产生菌显示出较大的差异，从溶血性角度看硫酸二乙酯降低溶血性效果好，经过3轮诱变筛选到无溶血性菌株，亚硝基胍经过6～10轮诱变筛选到无溶血性菌株，紫外诱变没有筛选到无溶血性菌株；从透明质酸产量及分子量增幅角度看依次为：亚硝基胍＞硫酸二乙酯＞紫外诱变。其中，采用亚硝基胍诱变得到一支突变株，摇瓶培养的条件下透明质酸产量达到0.498 mg/mL，分子量1.12×106u。

2）对照血平板和普通平板的菌落形态，高产菌株的菌落表面湿润、光滑，接种针挑起有明显的拉丝状态，菌落的黏性大，这直接可提供比对参考，作为平板分离初筛高产透明质酸突变体的依据，从而避免较为复杂、耗时的透明质酸的化学分析检测，降低筛选的工作强度。诱变过程出现菌落直径缩小、凸起更明显、菌落褶皱平铺形态的多种突变体，这种突变体与溶血性及产量没有趋势性关系。

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[1]Meyer K,Palmer J W.The Polysaccharide of the vitreous humor[J].BioChem,1934,10(7):629－634

[2]LaurentTC.BiochemistryofHyaluronan[J].ActaOtolaryngol（Stockh）,1987,44(2):7－12

[3]郭学平，凌沛平，王春喜，等.透明质酸的生产[J].药物生物技术,2000,7(1):61－63

[4]Barrie F C,Lars M B,Richard M.Microbialhyaluronic acid production[J].ApplMicro Biot,2004,66(4):341－351

[5]凌沛学.透明质酸[M].北京：中国轻工业出版社,2000:41－42

[6]Bitter T,Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,4(6):330－334

[7]丁东红，徐文静,等.利用玉米浆发酵生产类胡萝卜素红酵母的诱变选育,2010,21(9):159－162