响应面法优化桃花多糖提取工艺

耿明江，席荣英，喻传华，李欢欢，耿海局，陈振中

（1.新乡医学院化学教研室，河南新乡 453003；2.新乡医学院分析测试实验室，河南新乡 453003；3.新乡第一中学，河南新乡 453000；4.新乡医学院药学院08级药剂专业，河南新乡 453003）

多糖是广泛存在于动物、植物和微生物中的一类天然高分子化合物。近年来的研究表明许多多糖具有抗肿瘤[1-3]、抗衰老[3-4]、抗炎性[5]、降血糖[3，6-8]、降血脂[3，8]、增加免疫力[3，9-10]等多种生理功能。桃花是蔷薇科落叶乔木桃（Prunus persica）的花朵，古籍记载桃花“味苦，平，无毒”[11]，具有“破石淋，利大小便”[11]等作用。

响应面法是利用多元二次回归方程来拟合各因素与响应值之间的函数关系，进而分析回归方程得出最优工艺参数的一种统计方法。Box-Behnken设计因具有因素水平少、试验水平少等优点而成为响应面法中常用的设计方案，已广泛用于各类条件优化试验中。本文在单因素试验的基础上，利用响应面法优化桃花多糖（polysaccharide from peach blossoms，PPB）的最优提取工艺参数，以期为桃花多糖提取及其深入研究提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

桃花，2011年4月采集于卫辉市唐庄镇，经手工除杂、室内阴晾三天后粉碎，再置于2.5 kPa条件下恒温（40℃）干燥72 h，密封避光贮藏备用。D-葡萄糖标准品，中国药品生物制品检定所；乙醇、石油醚、三氯乙酸等所用试剂均为国产分析纯，使用前未做进一步纯化处理。实验用水均为去离子水。

1.2 主要仪器

UV2550紫外可见分光光度计：岛津（日本）；R-206旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；SBH-11循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；DZF-1恒温真空干燥箱：上海跃进医疗器械厂；FA2104电子分析天平：上海跃平仪器有限公司；FD-1A-80真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；TSH-4000离心机：天津医疗器械厂；HH-S.Z恒温水浴锅：郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

脱脂桃花粉末→热水提取→流水冷却→离心→上清液→4℃醇沉过夜→离心→沉淀复溶→脱蛋白→离心→上清液浓缩→冷冻干燥→灰白色粗多糖粉末。

1.3.2 多糖提取率的计算

本文在单因素试验还是响应面试验中原料质量均为（4.000±0.001）g。

1.3.3 单因素试验

影响多糖得率的因素比较多，本试验主要从提取温度、提取时间、料液比等几方面进行单因素试验[2]。提取温度选择 50、60、70、80、90、100 ℃ 6 个水平，提取时间选取 1、2、3、4、5 h 5 个水平，料液比选取 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）5 个水平分别进行试验。

1.3.4 响应面分析的实验方案和因素水平

根据预试验结果，在温度、时间和料液比3个单因素试验的基础上根据Box-Behnken中心组合试验原理，以多糖提取率为响应值采用三因素三水平的响应分析法进行试验设计。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面法设计因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2 结果与分析

2.1 PPB紫外光谱测定

PPB紫外光谱测定见图1。

从图1可知，脱蛋白前PPB在278 nm波长处有比较明显的吸收峰（a线），经三氯乙酸处理后的PPB在该波长下的吸收峰消失（b线）。由此说明经三氯乙酸处理后PPB中已经不含蛋白质。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对多糖提取率的影响

提取温度对多糖提取率的影响见图2。

由图 2（a）可知，在50℃～100℃的温度范围内，随着温度的升高，PPB得率在相应增大，但考虑到温度较高时水分挥发比较剧烈不易操作，因此选取80℃作为合适的提取温度。

2.2.2 提取时间对多糖提取率的影响

由图2（b）可知，当提取时间控制在1 h～5 h的范围内时，随着提取时间的延长，PPB得率在相应增大，只是当提取时间超过3 h后，PPB得率增加的趋势变得较为平缓，因此选择3 h作为合适的提取时间。

2.2.3 料液比对多糖提取率的影响

由图2（c）可知，料液比介于1∶10和1∶20之间时，PPB得率会随着溶剂体积的增加而相应增大，并且在1∶20（g/mL）时达到最大，这可能是因为在该料液比条件下PPB的溶出达到了一个最大值，此后随着溶剂体积的增加PPB得率会相应减小，可能与随着溶剂体积的增加在后处理过程中PPB损失较多有关。

2.3 响应面法试验结果

2.3.1 响应面分析方案及试验结果

响应面试验测定结果见表2，其中实验序号1～12为析因实验，13～17为5个中心实验，用来估计实验误差。运用Design Expert 7.1.6软件对表2数据进行多元回归分析。回归分析与方差分析结果见表3。

表2 响应面设计方案与试验结果Table 2 Response surface design and test results

概率P值越小则相应变量的显著性越高。从表3回归模型方差分析可以看出，模型是显著的（P=0.003 7），该模型R2=0.923 9，说明该模型与实验拟合较好，可用该模型对PPB提取得率进行分析和预测，对实践具有指导意义。由F检验可以得到各因子的贡献率为：A＞B＞C，即在所选取的各因素水平范围内，对实验结果的影响排序为：提取温度＞提取时间＞料液比。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 因素间的交互影响

固定任何一个因素在其编码值为0的水平，分析另外两个因素交互对PPB得率的影响，结果如图3所示。

图3直观地反映了各因素交互作用对PPB得率的影响，比较a、b、c三组图可以得知，提取温度因素曲线较陡峭，对PPB得率的影响最为显著，其次是提取时间，最后是料液比。这与前面方差分析结果一致。等高线的中心点不在相应坐标范围之内，说明PPB最佳提取条件不在各因素相应编码－1～1的范围之内。

2.3.3 方程求解及最佳条件

对表2进行回归拟合后，得回归方程为：

对回归方程取一阶偏导等于0，整理得方程组：

解方程组得：A=1.37；B=1.73；C=0.17，即最佳提取条件为 93.7 ℃，时间 4.73 h，料液比为 1∶20.85（g/mL）。考虑到实际操作的方便性，将最佳提取条件修正为：提取温度 94 ℃、提取时间 4.7 h、料液比为 1∶21（g/mL）。

为了验证响应面法的可行性，采用上述最优提取条件进行PPB得率验证试验，5次平行试验得到实际得率为11.08%，与理论预测值11.3%误差约为1.95%，表明该优化条件参数可靠，具有实用价值。验证试验结果见表4。

表4 验证性试验结果Table 4 Results of verifiable experiment

3 结论

通过单因素试验设计，在此基础上采用Design－Expert 7.1.6软件Box－Benhnken试验原理设计三因素三水平响应面分析法试验，确定PPB最佳提取工艺为：提取温度 94 ℃、提取时间 4.7 h、料液比为 1∶21（g/mL），多糖得率为11.3%。

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