建立MN-ZLW系列乳酸菌RAPD指纹图谱的研究

康小红，孙国庆，龄南，赵媛，张兰威，生庆海，*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特 011500；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150001）

我国乳酸菌资源丰富，主要来源于内蒙古、新疆、西藏等少数民族地区传统发酵乳制品，具有悠久的食用历史。目前，国内大部分发酵乳制品生产企业均使用国外乳酸菌，但随着国内研究机构、高等院校及企业对乳酸菌研究的深入和国家相关规定的健全，未来本土化乳酸菌会有巨大应用潜力。

乳酸菌为发酵“起子”其性能会直接影响产品的质量及口感。大量研究证明，不同菌属乳酸菌和同一菌属不同菌株特性均有差异[1-2]。中国对于食用乳酸菌有着严格的规定，如2010年卫生部办公厅关于印发《可用于食品的菌种名单》的通知中规定有21种菌可用于食品，2011年卫生部关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告中规定有4种菌株可用于婴幼儿食品中，此次指明6株菌。因此，准确鉴定乳酸菌和单一菌株指纹图谱识别体系的建立对发酵乳制品的开发具有重要意义。乳酸菌常用鉴定方法有16S rDNA基因序列分析，随机扩增多态性DNA技术（RAPD），脉冲场凝胶电泳（PFGE），扩增片段长度多态性分析（AFLP）等等。目前，权威机构常用方法为16 S rDNA基因序列分析方法，其具有高效、准确等优点，但成本高、方法复杂等缺点。其余方法中RAPD方法较为快捷、简单、经济、高效等优点[3-4]。本文在16 S rDNA基因序列分析基础上将选择RAPD技术建立MN-ZLW系列菌株的指纹图谱体系，从而为产品生产研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

选择3株乳酸菌，分别为MN-ZLW-001、MNZLW-002、MN-ZLW-003（来自内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司），具体信息见表1。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.1.2 药品

MRS培养基、革兰氏染色试剂盒：北京陆桥技术有限责任公司；RAPD核酸引子 5′-ACGCGCCCT-3′、琼脂糖凝胶：美国 Invitragen公司，Wizard Genomic DNA提取试剂盒、GoTag Real-Time PCR试剂盒：美国Promega公司；100 bp DNA Maker：美国Thermo公司；无毒荧光染色剂：上海开放生物有限责任公司；0.5×TBE缓冲溶液，去离子水。

1.1.3 设备

2 000 237恒温培养箱：西班牙J.P.SELECTA公司；NIKON E200正立显微镜：日本Nikon公司；Z-36HK台式高速冷冻离心机：德国Hermle公司；W20M-2水浴锅：美国 sheldon manufacturing公司；VORTEXGEMIE2旋涡混合器：美国SCIENTIFIC Instruments公司；2 720 Thermal Cycler PCR仪：美国GENE公司；WP800TL23-K3微波炉：广东佛山格兰仕公司；Mupid-One电泳套组：日本ADVANCE公司；BIORAD Gel Doc XR+凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态鉴定方法

将3株乳酸菌粉末分别稀释10倍，MRS琼脂培养基划线，37℃恒温培养48 h。利用光学显微镜观察菌落形态，载玻片固定单一菌落进行革兰氏染色，观察菌株形态。

1.2.2 RAPD技术建立乳酸菌指纹图谱方法

RAPD技术建立乳酸菌指纹图谱方法由提取DNA[5]，PCR扩增[6]和电泳成像等3个步骤组成。DNA提取方法：利用脱脂乳培养基将MN-ZLW-001、MN-ZLW-002、MN-ZLW-003等3株菌分别活化2代，第二代培养菌株划线于MRS琼脂培养基，于37℃条件下培养72 h，挑单一菌落接入MRS肉汤，于37℃条件培养18 h，乳酸菌数约为1×109CFU/mL。取1 mL乳酸菌MRS培养液离心（13 000×g，2 min，4℃），弃上清。依次添加50 mM浓度EDTA溶液480 μL，20 mM溶菌酶溶液 120 μL，并于 37℃ 条件下孵育 1 h，离心（13 000×g，2 min，4 ℃），弃上清；加细胞核裂解液 600 μL，于 80 ℃条件下孵育5 min，加核糖核酸酶3 μL，于37℃孵育30 min；加的蛋白质沉淀溶液200 μL，旋涡混合，离心（13 000×g，3 min，4℃）；将上清移入 1干净离心管中，加异丙醇 600 μL，离心（13 000×g，2 min，4 ℃），弃上清。加 70%乙醇 600 μL，离心（13 000×g，2 min，4℃），弃上清；空气干燥沉淀15 min，加DNA溶解液100 μL，于4℃条件放置24 h；利用紫外分光光度计检测其浓度。PCR扩增：配置25 μL样品，根据DNA样品浓度大小确定添加样品量，核酸引物添加2.5 μL，GoTagMIX添加 12.5 μL，用无核水进行补充至 25 μL；样品放置于PCR仪器，加热95℃2 min将双股DNA变性分离为单股，并循环30次（95℃ 30 s，27℃ 30 s，72℃30 s），最终以72℃5 min为延长DNA片段。电泳成像：配置1.5%琼脂糖凝胶100 mL，添加DNA染剂10 μL，制备 10 μL孔的凝胶；TBE缓冲液为电泳介质，凝胶孔中加入样品 1 μL，Marker 2 μL；电泳电压为100 V，40min；凝胶放入成像系统中进行照相；根据Marker条带确定试样条带分子量。

2 结果

2.1 MN-ZLW系列乳酸菌菌落形态及菌株形状

MN-ZLW-001乳酸菌菌落形态及菌株形状，见图1。

从图1看出，MN-ZLW-001菌落形态为圆形、边缘粗糙、显黄颜色、凸起、菌落大小中等；菌株形状为链球状，革兰氏染色显阳性。

MN-ZLW-002乳酸菌菌落形态及菌株形状，见图2。

从图2看出，MN-ZLW-002菌落形态为圆形、边缘整齐、显黄颜色、凸起、菌落偏小；菌株形状为链球状，革兰氏染色显阳性。

MN-ZLW-003乳酸菌菌落形态及菌株形状，见图3。

从图3看出，MN-ZLW-003菌落形态为星状菌落、边缘粗糙、乳白色、扁平、小菌落；菌株形状为杆状，革兰氏染色显阳性。

2.2RAPD建立MN-ZLW系列乳酸菌指纹图谱

MN-ZLW系列乳酸菌DNA电泳图谱，见图4。

从图4看出，MN-ZLW系列乳酸菌DNA组总分子量均大于3 000 bp，还能看出提取DNA中含有少量蛋白。

MN-ZLW系列乳酸菌RAPD指纹图谱，见图5。

MN-ZLW系列乳酸菌指纹图谱分子量，见表2。

从图5和表2中看出，MN-ZLW-001菌株RAPD指纹图谱主要条带有8个，其中470 bp和900 bp条带为特性条带；MN-ZLW-002菌株RAPD指纹图谱主要条带有5个，其中750 bp条带为特性条带；MN-ZLW-003菌株RAPD指纹图谱主要条带有3个，其中1000bp条带为特性条带。

表2 MN-ZLW系列乳酸菌指纹图谱分子量Table 2 The LAB MN-ZLW RAPD fingerprints Molecular Weight

3 讨论

MN-ZLW系列乳酸菌均来自我国少数民族地区传统发酵乳制品，如MN-ZLW-001菌株来自新疆维吾尔自治区塔城市牧民家庭鲜酸奶疙瘩，MN-ZLW-002菌株来自甘肃省甘南县牧民家庭自制发酵乳样品，MN-ZLW-003菌株来自新疆维吾尔自治区伊犁地区酸奶块。根据16S rDNA鉴定结果获知三株菌分别为两株嗜热链球菌和一株德氏乳杆菌保加利亚种，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本文发现3株菌均为革兰氏染色阳性菌，MNZLW-001菌株和MN-ZLW-002菌株为链球状，而MN-ZLW-003菌株为杆状。根据菌落形态发现MNZLW-001和MN-ZLW-002均为圆形，MN-ZLW-003为星状，说明MN-ZLW-003不同与MN-ZLW-001和MN-ZLW-002菌，而MN-ZLW-001菌株和MN-ZLW-002菌株的差异不明显。

随机扩增多态性DNA技术（RAPD）为利用随机引物通过PCR反应非特异性扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分析扩增DNA片段，呈现出一定形式的谱带，即通过DNA指纹图谱来完成其进化遗传分析。RAPD技术常用与细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析[7-8]。郑飞云（2007）利用RAPD技术快速检出啤酒污染菌[9]；Cagno（2010）利用 RAPD 技术成功分辨72株植物乳杆菌[10]；峥嵘（2010）利用RAPD技术分析乳酸菌片球菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌遗传特性，结果与传统方法结果吻合[11]；2010年，张家超等选用引物M13，选用该方法对乳酸乳球菌亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种进行区分[12]。目前，RAPD技术在乳酸菌鉴定领域中的应用已中逐渐增多，使用程度也日渐成熟。

本文利用RAPD技术建立MN-ZLW系列乳酸菌指纹图谱发现，MN-ZLW-001菌株有8个条带，MNZLW-002菌株有5个条带，MN-ZLW-003菌株只有3个条带，而且还发现每株菌浓度较高条带也不同，依次为 470 bp、900 bp，750 bp和 1 000 bp，说明 RAPD 技术建立的指纹图谱能有效分辨出菌株间差异。

4 结论

从形态学角度能分辨不同菌属，但无法分辨同属不同菌株。RAPD技术有快速、简单、经济等优点，有效分辨菌株间差异。本文利用RAPD技术成功建立MNZLW系列乳酸菌指纹图谱，这对于MN-ZLW系列菌株的知识产权的保护及生产加工具有重要意义。

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