板蓝根总生物碱的含量测定方法研究

黄润芸，陈 凯，崔清华，李慧芬，张晓平，田景振

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

板蓝根(Radix Isatidis)是十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽的功效，临床上主要用于温热病热毒入于营血及温热病初起或外感风热诸症［1］。有研究表明板蓝根中总生物碱是其抗病毒有效物质［2］，目前板蓝根总生物碱的含量测定方法尚未见文献报道，本实验采用酸性染料比色法建立板蓝根总生物碱含量测定方法，并进行方法学考察，可以满足板蓝根总生物碱含量测定的需要。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV－2010型紫外可见分光光度计(日立公司)。

1.2 试药 4－(3H)－喹唑啉(Sigma公司，批号:20100521)，磷酸二氢钾(分析纯，天津科密欧，批号:20071126)，溴麝香草酚蓝(分析纯，天津科密欧，批号:20041024)，732离子交换树脂(国药集团化学试剂，批号:10024260)，蒸馏水，其他试剂均为化学纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取4(3H)－喹唑啉对照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，1%盐酸乙醇溶液溶解并定容，摇匀，作为对照品溶液(每1 mL含4(3H)－喹唑啉1 mg)。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取板蓝根最粗粉20 g，加入一定量的80%乙醇水溶液，浸泡36 h，装入渗漉筒中(3×10 cm)。用15倍量80%乙醇水溶液渗漉提取，流速控制为1 mL·min－1。收集渗漉液，回收溶剂至近干，用80%乙醇溶液溶解并定容至50 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2 不同pH值缓冲溶液的制备

2.2.1 pH 4.5醋酸－醋酸钠缓冲液的配制 称取醋酸钠18 g，加冰醋酸9.8 mL，溶解后再加水稀释至1000 mL，即得。

2.2.2 pH 5.0 磷酸盐缓冲液的配制 取 0.2 mol·L－1磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得。

2.2.3 pH 6.0醋酸－醋酸钠缓冲液的配制 称取醋酸钠54.6 g，加 1 moL·L－1醋酸溶液 20 mL，溶解后加水稀释至500 mL，即得。

2.2.4 pH 6.8磷酸二氢钾缓冲液的配制 取 0.2 moL·L－1磷酸二氢钾溶液 250 mL，加 0.2 moL·L－1NaOH 118 mL，用水稀释至1000 mL，即得。

2.2.5 pH 7.6磷酸二氢钾缓冲液的配制 称取磷酸二氢钾27.22 g，加水使溶解成 1000 mL，取50 mL 加0.2 moL·L－1NaOH溶液42.4 mL，再加水稀释至200 mL，即得。

2.2.6 溴麝香草酚兰溶液的配制 精密称取溴麝香草酚兰0.0300 g，溶于1 moL·L－1NaOH 溶液0.5 mL 中，加水稀释并定容至100 mL容量瓶中。

2.3 检测波长的选择 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1 mL置分液漏斗中，加入5 mL醋酸－醋酸钠缓冲液和5 mL溴麝香草酚兰溶液，摇匀，用40 mL三氯甲烷分4次萃取，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中。以三氯甲烷作空白扫描紫外全波长图谱(酸性染料缓冲液不做空白，因其在该波长处紫外吸收无干扰)。二者在417.5 nm处均有最大吸收，故选择检测波长为417.5 nm。

图1 对照品溶液全波长扫描图 图2 供试品溶液全波长扫描图

2.4 含量测定方法相关条件单因素考察研究

2.4.1 不同pH值缓冲液考察 精密吸取0.5 mL供试品溶液5份置分液漏斗，分别加入5 mL 2.2项下不同pH值为:4.76、5.20、6.10、6.75、7.62 的缓冲液，再加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚兰溶液，摇匀，用40 mL三氯甲烷分4次萃取，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中，以三氯甲烷作空白，于417.5 nm处测吸光度。测得吸光度分别为:0.348、0.450、0.640、0.216、0.018。由此选择缓冲液pH值为:6.10。

2.4.2 酸性染料用量考察 精密吸取0.5 mL供试品溶液5份置分液漏斗中，分别加入5 mL pH 6.0醋酸－醋酸钠缓冲液，再分别加入1、2、3、4、5、6 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚兰溶液，其余操作同2.4.1 项下。测的吸光度分别为:0.146、0.261、0.506、0.564、0.690、0.678。由此选择酸性染料用量为5 mL。

2.4.3 缓冲液用量的考察 精密吸取0.5 mL供试品溶液5份至分液漏斗，分别加入 3、4、5、6、7 mL pH 6.0 醋酸 － 醋酸钠缓冲液，再分别加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚兰溶液，其余操作同 2.4.1项下。测得吸光度分别为:0.716、0.735、0.752、0.736、0.727。由此选择缓冲液用量为5 mL。

2.4.4 三氯甲烷萃取液用量考察 精密吸取0.5 mL供试品溶液5份至分液漏斗，分别加入5 mL pH 6.0醋酸－醋酸钠缓冲液，再分别加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚兰溶液，摇匀，分别用三氯甲烷萃取1、2、3、4、5 次，每次10 mL。其余操作同 2.4.1 项下。测得吸光度分别为:0.465、0.592、0.678、0.691、0.696。由此选择三氯甲烷萃取4 次，每次10 mL。

综上所述，选择pH 6.0醋酸－醋酸钠缓冲液溶液，缓冲液用量为5 mL，溴麝香草酚兰溶液用量为5 mL，三氯甲烷萃取4次，每次10 mL。

2.5 线性关系的考察 精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL对照品溶液，加5 mL pH 6.0醋酸－醋酸钠缓冲液，加入5 mL 0.03 g·(100 mL)－1溴麝香草酚兰溶液，摇匀，用三氯甲烷萃取4次，每次10 mL。收集三氯甲烷萃取液定容至50 mL容量瓶中，以三氯甲烷作空白，于417.5 nm处测吸光度，由实验结果得线性回归方程为:Y=0.023X+0.222，r=0.9999。说明4(3H)－ 喹唑啉在 4 ～24 μg· mL－1浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度实验 从同一批次供试品溶液中精密吸取0.5 mL溶液6份，按2.4项下方法处理并测定吸光度，RSD=0.16%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 精密称取板蓝根粉末6份，各1.0g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液0.5 mL，置于分液漏斗中，按“2.4”项下方法操作，于 417.5 nm处依法测定吸光度，计算其平均含量为23.20%，RSD为0.14%。表明该方法重现性良好。

2.8 稳定性实验 从供试品溶液中精密吸取0.5 mL溶液，按2.4项下方法处理并测定吸光度，从第一次测A开始计时，分别测定0、15、30、45、60、90、120 min 后的吸光度，样品2 h内颜色无明显变化，吸光度RSD=1.04%，表明供试品溶液在120 min内具有良好的稳定性。

2.9 加样回收试验 从已知浓度的供试品中精取0.5 mL溶液6份，分别加入0.2 mL对照品溶液，按2.4项下方法处理并测定吸光度，计算加样回收率(n=6)，平均回收率为100.3%，RSD=2.17%。

3 不同批次板蓝根中总生物碱含量测定

从3批板蓝根中各取20 g，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取0.5 mL，按2.4项下方法测定总生物碱含量，每批次测3次取平均值，3批药材中总生物碱含量分别为:5.81%、5.79%、5.83%，RSD=0.34%。

4 小结与讨论

在实验过程中发现溴麝香酚蓝显色剂放置一段时间后会不稳定，因此显色剂应现用现配，从而保证测定结果的准确性。此外，严禁在三氯甲烷萃取液中混入水分，否则会使溶液变浑浊，影响比色结果。所以在测定吸光度前，必须用脱水剂(如无水硫酸钠)除去萃取溶剂中的水分。有研究表明板蓝根抗病毒物质基础是总生物碱，而2010版《中国药典》中仅对(R，S)－告依春(C5H7NOS)含量做明确要求，故笔者认为对总生物碱的含量测定考察有相当的意义。总生物碱的含量测定方法有酸碱中和滴定法和酸性染料比色法，两种方法相比较而言，前者的含量测定结果误差较大［3］，而后者准确性较好，灵敏度更高，重现性好。本实验建立了酸性染料比色法测定板蓝根总生物碱含量，适用于板蓝根总生物碱的含量测定。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:191.

［2］ELLiott MC.Compands from isatis indigotica［J］.Phytochemistry，1970，9:1629.

［3］刘喜纲，刘翠哲，常金花.应用酸性染料比色法测定总生物碱的含量［J］.中国药房，2007，18(11):875 －876.