宫颈疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的检测及临床意义

袁冬兰，钱华

（泰州市人民医院妇产科，江苏泰州225300）

宫颈疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的检测及临床意义

袁冬兰，钱华

（泰州市人民医院妇产科，江苏泰州225300）

目的检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤变患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的表达，分析其临床意义。方法荧光抗体CD127-FITC、CD4-PECY5、CD25-PE标记T细胞，流式细胞术测定50例宫颈癌患者和49例宫颈上皮内瘤变患者中CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的表达。结果与正常对照组[n=33，(8.07±2.18)%]比较，宫颈癌组[n=50，(11.15±1.97)%]、宫颈上皮内瘤变组[n=49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/low均显著升高，两者比较差异有统计学意义（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）；与宫颈上皮内瘤变Ⅰ级组[n=16，(8.96±0.65)%]比较，宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级组[n=33，(11.54±2.72)%]显著升高，两者比较有差异统计学意义（t=4.114，P＜0.001）；与宫颈癌Ⅰ期组[n=20，(10.34±1.79)%]比较，宫颈癌Ⅱ期组[n=30，(11.68±1.97)%]显著升高，两者比较差异有统计学意义（t= 2.424，P＜0.05）。结论外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的表达升高可能在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变发病的发生、发展过程中起一定作用。

宫颈癌；宫颈上皮内瘤变；CD4+CD25+CD127-/lowTreg

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，发病率位于女性肿瘤的第2位。全世界每年有20多万女性死于宫颈癌。研究表明，肿瘤的发生与机体免疫逃避有关[1]，调节性T淋巴细胞(Treg)具有免疫无能性和免疫抑制性，是肿瘤免疫抑制的重要途径之一。CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制特性的T淋巴细胞亚群，在外周免疫应答的调节中发挥重要作用[2]。该细胞亚群能够抑制自身免疫病的发生，参与肿瘤免疫的调节。我们对宫颈癌和宫颈上皮内瘤变患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞进行研究，分析其在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品，用CELLQuest软件（BD公司）获取和分析实验数据。鞘液用Systmex公司的Cellpack血细胞稀释液。

1.1.2 试剂CD4-PeCy5(Code No：MHCD0406)、CD25-PE(Code No：MHCD2504)及其同型对照Mouse IgG1-PE(Code No：MG104)由Invitrogen公司提供；CD127-FITC(Clone：Ebiordr5)和同型对照Mouse IgG1-FITC k Isotype Control(clone：P3)由eBioscience公司提供。

1.1.3 研究对象选取2010年1～12月在我院初诊的宫颈癌患者50例(宫颈癌组)，年龄31～75岁，平均(50±7)岁；宫颈上皮内瘤变患者49例(宫颈上皮内瘤变组)，年龄28～54岁，平均(42±6)岁。另选择我院健康体检健康志愿者33例(正常对照组)，年龄25～58岁，平均(35±8)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本准备受试者均于清晨空腹状态下抽取外周静脉血EDTA-K2抗凝2 ml，标本在6 h之内测定。

1.2.2 CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的测定将试管分为两组，测定管加入CD4-PeCY5和CD25-PE各5µl、CD127-FITC 20µl，对照管加入CD4-PeCY5和Mouse IgG1-PE各5µl、Mouse IgG1-FITC 20µl；将标本充分混匀，分别加50 ml EDTA-K2抗凝血于上述两组试管中，震荡器上充分混匀，避光放置15 min；加入溶血素2 ml，充分震荡，避光放置10 min。1 500 rpm离心5 min弃上清，加入生理盐水2 ml震荡，1 500 rpm离心5 min弃上清，加入生理盐水100µl，充分震荡混匀，待测。

1.2.3 流式细胞仪器设置及数据分析用FACSComp调整仪器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的电压及补偿。用CELLQuest软件获取20 000个淋巴细胞进行分析。选取CD4+细胞进行分析，分别以同型对照管调整Marker的位置。在同等的实验条件下，用以分析测定管中CD4+CD25+CD127-/lowT细胞占CD4+T细胞的比例（见图1）。

图1 CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞测定图

1.3 统计学处理采用sigmastat3.1软件进行统计分析，文中正态分布数据以均数±标准差()表示。两组样本间正态分布采用t检验进行分析，多组样本间采用One Way ANOVO的单因素方差分析进行检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈上皮内瘤变患者、宫颈癌患者及正常对照组外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞比较结果显示，与正常对照组[n=33，(8.07±2.18)%]比较，宫颈癌组[n=50，(11.15±1.97)%]、宫颈上皮内瘤变组[n= 49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞均显著升高，两者比较差异有统计学意义（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）。而宫颈癌组和宫颈上皮内瘤变组比较差异无统计学意义（t=1.161，P=0.249）。

2.2 宫颈上皮内瘤变患者不同分期患者组外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞比较结果显示，与宫颈上皮内瘤变Ⅰ级组[n=16，(8.96±0.65)%]比较，宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级组[n=33，(11.54±2.72)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg显著升高，两者比较差异有统计学意义（t=4.114，P＜0.001）。

2.3 宫颈癌不同分期患者组外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞比较结果显示，与宫颈癌Ⅰ期组[n=20，(10.34±1.79)%]比较，宫颈癌Ⅱ期组[n=30，(11.68±1.97)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞显著升高，两者比较差异有统计学意义（t=2.424，P＜0.05）。

3 讨论

肿瘤的发生、发展与人体的免疫功能密切相关，T淋巴细胞在其中起了尤其重要的作用[1]。Treg细胞是一类具有免疫抑制特性的T淋巴细胞亚群，在外周免疫应答的调节中发挥重要作用[2]。Treg细胞根据表面标志、分泌的细胞因子及发挥作用的方式，可分为多种亚群，主要包括CD4+CD25+天然Treg、Ⅰ型Treg (Tr1)及Th3。CD4+CD25+Treg起源于胸腺，并作为一个独立的T细胞亚群在胸腺发育、分化和成熟。近年来CD4+CD25+Treg的分子标志也已逐渐被识别，其高水平表达IL-2αR(CD25)、CTLA-4、GITR、CIM4、CD45等分子，而低表达CD45RB分子[3]。最初选用高表达CD25（CD25hi）的细胞群作为对CD4+CD25+Treg的界定方法。这样得到的Treg细胞不准确，因为经免疫激活的效应性T细胞CD25的表达也会上调，使之很难区分Treg细胞和效应性T细胞。转录因子FoxP3在天然Treg细胞发育及功能维持中发挥了关键的作用[4]。许多学者采用Foxp3转录因子作为Treg细胞内的特征性标志物[5]。但FoxP3为胞内蛋白，该方法需要固定、穿孔、染色，操作繁琐，难以在临床和科研中推广。我们在前期研究显示，CD4+CD25highCD127low亚群主要是表达FOXP3+的调节性T细胞(CD4+CD25high FOXP3+Treg)，CD4+CD25+CD127-/low细胞亚群与可以较准确反映CD4+CD25high FOXP3+Treg细胞的数量[6]。因此我们用CD4+CD25+CD127-/low的界定方法对宫颈癌、宫颈上皮内瘤变患者外周血细胞Treg进行定义分析。结果显示：宫颈癌、宫颈上皮内瘤变患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均显著高于正常对照人群，可能是CD4+CD25+CD127-/lowTreg升高使机体免疫系统受抑制，监视体内突变细胞能力下降。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的表达升高可能在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变发病中起重要作用。

恶性肿瘤的发生、发展与机体的免疫监视功能有非常密切的关系。机体的免疫调节功能不仅能抑制自身免疫性疾病发生，还可能参与肿瘤免疫的调节。肿瘤的免疫逃逸机制之一是Treg细胞对抗肿瘤免疫的抑制作用。目前许多研究显示多种肿瘤患者外周血和肿瘤部位可发现CD4+CD25+Treg细胞数量和比例增加[7-8]。我们对不同分期的宫颈癌、宫颈上皮内瘤变患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞进行分析显示：宫颈上皮内瘤变Ⅰ级患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均显著高于宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级患者。宫颈癌Ⅰ期患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均显著高于宫颈癌Ⅱ期患者。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞可能与宫颈癌、宫颈上皮内瘤变的分期、分级相关。说明外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg细胞的表达升高可能在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变发病的发生、发展过程中起一定作用。但其在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变发病的疗效观察和预后评估中的作用如何还有待进一步研究。

[1]Kennedy R,Celis E.Multiple roles for CD4+T cells in antitumor immune responses[J].Immunol Rev,2008,222：129-144.

[2]Stephens LA,Barclay AN,Mason D.Phenotypic characterization of regulatory CD4+CD25+T cells in rats[J].Int Immunol,2004,16(2)：365-375.

[3]Shevach EM.CD4+CD25+suppressor T cells：more question than answers[J].Nat Rev Immunol,2002,2(6)：389-400.

[4]Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4(4)：330-336．

[5]Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance：regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6(4)：331-337.

[6]叶军,陈亚宝,徐洪涛,等.流式细胞术不同设门方法对CD4+CD25+调节性T细胞的检测方法比较[J].中华生物医学工程杂志, 2010,16（5）：495-498.

[7]Ikemoto T,Yamaguchi T,Morine Y,et a1．Clinical roles of increased poulations of Foxp3+CD4+T cells in peripheral blood from advanced pancreaticcancer patients[J].Pancreas,2006,33(4)：386-390.

[8]Golgher D,Jones E,Powrie F,et a1.Depletion of CD25+regulatory cells uncovers immune response to shared murine tumor rejection antigens[J].Eur J Immunol,2002,32(11)：3267-3275.

Detection of the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix diseases and its clinical significance.

YUAN Dong-lan,QIAN Hua.Department of Gynecology&Obstetrics,People's Hospital of Taizhou City,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix cancer and cervical intraepithelial neoplasia(CIN),and to explore its clinical significance.Methods T cells were marked with fluorescence antibody CD127-FITC,CD4-PECY5,CD25-PE.The levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells were detected by flow cytometry in 50 patients with cervix cancer(group A),49 patients with CIN(group B),and 33 healthy individuals(the control group).ResultsCompared with the control group[(8.07±2.18)%],the levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in group A[(11.15±1.97)%]and group B[(10.61±2.62)%]were significantly higher(t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001).The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with CIN of gradeⅡ～Ⅲ[n=33,(11.54±2.72)%]was significantly higher than that in patients with CIN of gradeⅠ[n=16,(8.96±0.65)%], with t=4.114 and P＜0.001.The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with cervix cancer of stageⅡ[n=30, (11.68±1.97)%]was significantly higher than that of patients with cervix cancer of stageⅠ[n=20,(10.34±1.79)%], with t=2.424 and P＜0.05.ConclusionCD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in the peripheral blood might play an important role in the development and progression of cervix cancer and CIN.

Cervix cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;CD4+CD25+CD127-/lowTreg

R446.61

A

1003—6350（2012）04—011—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.04.004

2011-09-06）

袁冬兰（1973—），女，江苏省泰州市人，副主任医师，学士。