缬沙坦对血管损伤小鼠血管重构的影响

王筱梅，刘少奎，陈士毅，洪军，穆鑫，王翠荣，赵越超

血管内膜损伤是血管腔狭窄的始动因素，而狭窄的关键在于血管平滑肌细胞增殖迁移致内膜增生，血管外膜炎症、外膜成纤维细胞、外膜脂肪组织等均可能与内膜病变的发生相关[1]。文献报道[2]，在小鼠的股动脉上安置聚乙烯套管可造成血管损伤，发生血管重塑，导致血管腔内径变小，血管壁的结构和厚度发生改变。而这些改变正是心血管疾病如高血压、冠心病、血管成形术后再狭窄发生发展的共同基础。研究发现，血管紧张素转换酶受体拮抗剂类药物具有抑制血管重塑[3]等作用。本研究通过建立小鼠血管损伤模型，给予临床上常用的血管紧张素转换酶受体拮抗剂缬沙坦，观察血管内膜、中膜面积的变化以评价血管紧张素转换酶受体拮抗剂类药物缬沙坦在抑制损伤血管内膜增厚和血管重构重构方面的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠80只，体重（30～35）g【购自大连医科大学实验动物中心，许可证号SCXK（辽）2010-0003】。随机分为4组（每组20只）：手术组、治疗组、假手术组、对照组。手术组：行聚乙烯套管包裹股动脉手术，术后开始蒸馏水灌胃治疗（1 ml/次，qd）；治疗组：行聚乙烯套管包裹股动脉手术，术后开始缬沙坦灌胃治疗（10 mg/kg，qd）；假手术组：游离出股动脉不套管，术后不灌胃；对照组：不手术，不灌胃。统一于第14天处死小鼠。

1.2 聚乙烯套管包裹股动脉手术 手术在室温下进行，1%戊比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，沿腹股沟中点纵行切开皮肤，暴露股动脉鞘，游离出股动脉，长约3mm。用2.0mm的PE-50聚乙烯套管（内径：0.56mm；外径：0.965mm；美国 Becton Dickinson 公司），纵向切开后松散地包裹于股动脉外，以8号缝线捆绑固定，双侧股动脉复位。套管内径大于股动脉管径，不阻碍血液流动。逐层缝合伤口，使小鼠自行恢复。据文献报道，套管处内膜增厚则提示造模成功[4，5]。术后予腹腔注射青霉素16万单位预防感染（qd×3d）。

1.3 标本采集、保存及血管形态学观察 腹腔注射过量戊比妥钠处死，先用心脏插管注入PBS液冲洗血管，同时剪碎肝脏迅速放血，尽量使股动脉内的血液流出，应用PBS液冲洗并保持股动脉结构不破坏，剪取约2mm，各组随机抽取15条不同小鼠股动脉，置于4%的多聚甲醛溶液中固定10小时，石蜡包埋待用。标本处理：取股动脉两端和中部按5μm厚度连续切片（每部分取3张切片观察），苏木素和伊红（HE）染色后，在光学显微镜下数码照相后输入计算机。血管内弹性板与血管腔之间的面积定义为新生内膜面积，新生内膜和中膜的面积采用NIH分析软件测量，准确勾出外弹力膜（EEL）、内弹力膜（IEL）以及管腔轮廓，测算出内膜面积、中膜面积，其中内膜面积=[(内弹力膜周径)2-(管腔周径)2]/4π,中膜面积=[(外弹力膜周径)2-(内弹力膜周径)2]/4π。每个目标血管取3张切片测量后的平均值。

1.4. 统计学分析 采用SPSS17.0统计分析软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（）表示。形态学分析多组间比较，采用完全随机设计单因素方差分析，多个样本均数间两两比较采用SNK-q法；组内比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型评价及血管形态学比较 镜下观察小鼠股动脉病理切片，正常组与假手术组内膜为单层单核细胞，未见增厚；手术组、治疗组套管处内膜则呈城墙样折叠，血管内膜增厚；手术组内膜增厚明显。中膜为染色为红色的除内膜外的部分，假手术组、手术组、治疗组的中膜与对照组比较无增厚（图1）。

2.2 内膜和中膜面积比较（表1） 对照组、假手术组未见新生内膜形成，手术组与治疗组有新生内膜形成。手术组与其余3组比较，新生内膜面积均值较大，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组较对照组新生内膜增加，差异有统计学意义（P＜0.05），证明造模成功且药物治疗不能完全抑制血管内膜增生。各组中膜中膜面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组新生内膜面积、中膜面积比较( ,µm2)

3 讨论

血管重构是心脑血管疾病发生发展的基本病理改变，抑制血管重构，保护血管内皮，控制动脉硬化的始动环节，是防治心血管疾病的新趋势与重要研究方向。

长期以来人们研究所采用的多为apoE(-／-)小鼠高脂饮食、动脉结扎阻碍血流法的动物模型，但是鉴于临床心血管疾病趋于年轻化及目前研究认为血管外膜与内膜存在相关性，若能以非动脉硬化危险因素参与、非动脉内皮细胞增殖为动脉硬化形成始动因素的模型作为研究对象更具有现实意义。依据国外文献报道，采用聚乙烯套管方法致小鼠动脉损伤模型很好地满足了上述条件。由于血管周围异物的刺激，次日在造膜部位便可产生强烈的炎性反应，2周后血管腔内膜明显增生；病理显示增生的内膜主要以平滑肌细胞为主，这种病理改变与人类动脉硬化的内膜病变具有相似性[4、5]。故本实验选用该模型反应血管重构情况。我们在日本学者Hirosumi等成功的在兔子颈动脉上开发了塑料微导管血管损伤模型基础上，根据学者Akishita、Moroi等在小鼠股动脉建立损伤模型的方法，成功建立小鼠股动脉塑料微导管损伤模型（Cuff植入模型）。

上世纪60年代Wilcox就提出，在动脉粥样硬化损伤血管外膜周围存在有炎症和纤维化[6]。在小鼠股动脉周围无菌性炎症的实验观察中发现，细胞粘附分子-1（ICAM-1）,血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）在外膜早期都有所表达，随着炎症反应的逐渐增加，小鼠股动脉内膜也逐渐出现了ICAM-1和VCAM-1，提示血管外膜炎症可能会导致血管内皮细胞功能障碍[7]。血管内皮增生是血管平滑肌细胞在损伤过程中向内膜增殖和迁移的特征性表现[8,9]，Viswanathan等[10]发现大鼠颈动脉内皮损伤后，增殖的血管平滑肌细胞中血管紧张素AT1受体表达增多，提示损伤的局部血管壁血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）增多。我们推测，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素转换酶受体拮抗剂（ARB）可通过阻断AngⅡ的介导反应，从而抑制血管内皮细胞的表达，影响血管重构，延缓动脉硬化及心血管病的进展。

研究结果显示，对照组、假手术组病理切片均未见中膜增厚，也未见明显的新生内膜形成，表明手术操作未对血管外膜造成刺激，可除外人为的手术操作对血管内膜造成的影响；手术组与对照组比较未见中膜增厚，但可见内膜细胞明显增生，进一步证实血管外膜炎症可通过促使平滑肌细胞迁移致使血管内皮细胞增殖，导致内膜增厚、管腔狭窄，进一步加速动脉硬化及心血管疾病的发展。治疗组血管内膜增厚面积较手术组明显减轻，说明缬沙坦能够抑制血管平滑肌细胞向内膜增殖和迁移，进而抑制血管外膜炎症所致的内膜增生作用。

本实验采用国外多见而国内少有的小鼠股动脉塑料微导管损伤模型（Cuff植入模型），结合病理切片检测，表明血管外膜受到无菌性炎症刺激后会导致血管内膜异常增生[11]，因此研究组认为在动脉硬化，血管再狭窄等疾病的发生发展中，血管外膜也起到了很重要的作用。缬沙坦能够明显抑制血管损伤后内膜增生，防止血管重构的作用，其机制可能与抑制AngⅡ有关，对动脉硬化、血管损伤后再狭窄等心血管疾病有一定的治疗意义。

本实验不足之处在于观察时间较短，而缬沙坦对内膜增生抑制效应是否能够长期有效还需进一步证实。

[1]Siow RC,Mallawaarachchi CM,Weissberg PL. Migration of adventitial myofibroblasts following vascular balloon injury:insights from in vivo gene transfer to rat carotid arteries[J].Cardiovasc Res,2003,59(1):212-21.

[2]Martinet W,Knaapen MW,De Meyer GR,et al. Elevated levels of oxidative DNA damage and DNA repair enzymes in human atherosclerotic plaques[J]. Circulation,2002,106(8):927-32.

[3]Barker AT,Massett MP,Korshunov VA,et,al. Angiotensin Ⅱ type 2 receptor expression after vascular injury[J]. Hypertension,2006,48(5):942-49.

[4]Liu HW,Iwai M,Takeda-Matsubara Y,et al. Effect of estrogen and AT1 receptor blocker on neointima formation[J]. Hypertension,2002,40(4):451-7.

[5]Suzuki J,Iwai M,Nakagami H,et al. Role of angiotensin 2-regulated apoptosis through distinct AT1 and AT2 receptors in neointimal formation[J]. Circulation,2002,106(7):847-53.

[6]Wilcox JN,Scott NA. Potential role of the adventitia in arteritis and atherosclerosis[J]. Int J Cardiol,1996,54(Suppl):S21-35.

[7]高琳琳,翟同钧,陈融等.外膜炎症诱发载脂蛋白基因敲除小鼠冠状动脉粥样硬化病灶[J].中国动脉硬化杂,2003,11(5):415-8

[8]Shi Y,O’Brien JE,Fard A,et al. Adventitial myofibroblasts contribute to neointimal formation in injured porcine coronary arteries[J]. Circulation,1996,94(7):1655-64.

[9]West NEJ,Guzik TJ,Black E,et al. Enhanced superoxide production in experimental venous bypass graft intimal hyperplasia,Role of NADPH oxidase[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21(2):189-94.

[10]Viswanathan M,Seltzer A,Savedra JM. Heterogeneous expression of angiotensin II AT1 receptors in neointima of rat carotid artery and aorta after balloon catheter injury[J]. Peptides,1994,15(7):1205-12.

[11]刘英杰,刘少奎,王筱梅,等. 阿托伐他汀对血管损伤小鼠血管重构的干预研究[J].中国循证心血管医学杂志,2011,3(5):374-378.