外源性皮质酮对大鼠主动脉内皮细胞热休克蛋白70表达的影响

王晓兵，田国祥，张薇，张海娟

研究发现，血管内皮细胞通过合成和分泌多种多肽和蛋白质产物参与调控凝血和纤溶，调节血管运动张力，控制血管平滑肌细胞增殖以及炎症反应过程等，是机体内最富活性的细胞之一。血清皮质酮（corticosterone）增多是机体应激时的一个重要表现。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）参与蛋白质的合成、折叠、装配、转运和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳。但血清皮质酮增多是否对主动脉内皮细胞HSP有影响尚不十分清楚。本研究利用皮质酮对大鼠主动脉内皮细胞进行干预，旨在观察皮质酮对动脉内皮细胞HSP70表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 健康Wistar大鼠（清洁级），体重（120±10）g，购自第三军医大学动物所；皮质酮购自Sigma 公司；抗HSP70抗体购自Santa Cruz 公司。Elx800 型酶标仪为BIO2TEK公司产品；倒置光学显微镜（BX60）为德国Leica 公司产品；PCR仪为Eppendorf 公司产品。

1.2 模型制做及分组 采用大鼠主动脉“环”植块[1]进行大鼠主动脉内皮细胞培养及传代。实验用大鼠主动脉内皮细胞随机分为4组：正常组(未干预组，n=5)、皮质酮干预量效组（包括3组）：0.1μ m 组（n=5）、50μM 组（n=5）和100μM 组（n=5）。量效组加入皮质酮的终浓度分别为：0.1μM、50μ M 和100μ M ，再继续培养2 h、4 h、6 h、12 h、24 h和72 h后，收集细胞，作进一步实验。

1.3 细胞总蛋白提取及蛋白含量测定 采用Bradford法[2]，以牛血清白蛋白（BSA）为测量标准蛋白质，并将其配置成0.5 mg/ml。取5支EP管分别加入0.5 mg/ml BSA 5μl、10μl、15μl、20μl、25μ 1，再加0.15 mmol/L NaCl补足100μl；另取一支EP管加入100μl 0.15 mmo1/L NaCl，作为空白对照。然后，每支EP管中各加入1 ml考马斯亮蓝G-250染液，充分混匀，室温下放置2 min，用1 cm光径的比色杯测595 nm波长处的吸光度（A595），以A595与对应的标准BSA浓度作标准曲线。再以同样的方法测量待测蛋白样品A595，对照标准曲线计算出样品蛋白含量。

1.4 细胞总RNA的提取及RT-PCR 细胞总RNA的提取：将收集的细胞，加1ml Tripure，4℃，12000 g离心10 min，收集上清液。在室温静置匀浆上清液5 min。加0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s。室温放置（2～15）min。4℃，12000 g离心15 min。吸取上层无色水相，加入异丙醇0.5ml，颠倒数次，混合均匀。-20℃静置15 min沉淀RNA。4℃，12000 g离心15 min，去上清液。加入1ml 预冷的75%酒精，洗涤沉淀。4℃，7500 g离心5 min，去上清液，37℃烤干沉淀。加入适量的DEPC处理过的消毒双蒸水，重悬RNA并进行RNA定量。PCR引物设计与合成：从GenBank中查找大鼠HSP70和GAPDH基因序列，应用Primer 4.0引物设计软件，按照引物设计的基本原则，并优选跨不同外显子的一对引物。设计好的引物由上海生物工程公司合成。HSP70引物序列如下：上游引物：5'-GTT TCC TTC CTG CGA ACA CCT C-3'；下游引物5'-CCC AAC TAC AGC ACC ACC CTA C-3'。GAPDH引物序列如下：上游引物：5'-GTG ACT TCA ACA GCA ACT CCC ATT C-3'；下游引物：5'-GTT ATG GGG TCT GGG ATG GAA TTG TG-3'。

1.5 琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物 用0.5×TBE电泳缓冲液配置1.5%琼脂糖凝胶，微波炉溶胶后加入溴化乙锭使其终浓度为0.5 μg/ml，倒胶制板，取PCR产物15μl，加5μl DNA上样缓冲液，混匀后上样。5 V/cm正负极距离恒压电泳，电泳完毕后，紫外透射仪下观察电泳带并照相。用Gel Doc 2000凝胶图像分析仪对凝胶进行扫描和图像分析：PCR产物量以积分光密度O Du×面积表示，以正常和干预后HSP70 PCR产物的测定值与内参GAPDH测定值的比值来表示HSP70mRNA的相对表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间差异采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠主动脉内皮细胞HSP70含量及量效动态变化 皮质酮干预内皮细胞2 h后，量效组（0.1μM组、50μM 组和100μM 组）内皮细胞总蛋白中HSP70的含量显示明显增加；皮质酮干预内皮细胞4h后，各组内皮细胞总蛋白中HSP70的含量达到峰值，其中以0.1μM 组HSP70的蛋白含量增加最为明显。皮质酮干预内皮细胞72 h后，量效组内皮细胞HSP70的蛋白含量仍有少量表达（图1）。

2.2 皮质酮干预4h后HSP70 mRNA的表达水平根据各组蛋白水平量效变化曲线，通过PCR重点检测了正常组（未干预组）和0.1μM 组皮质酮干预4 h大鼠主动脉内皮细胞中HSP70 mRNA水平。结果显示，HSP70在正常情况下表达较弱，皮质酮干预4 h后，其表达显著提高（图2）。

3 讨 论

图1 皮质酮干预后大鼠主动脉内皮细胞总蛋白中HSP70的含量及量效动态变化[A: 内皮细胞总蛋白中HSP70量效动态变化；B: 0.1μ M组内皮细胞总蛋白中HSP70的时间变化；C: 皮质酮干预4 h各组内皮细胞总蛋白中HSP70的含量]

图2 皮质酮干预4 h HSP70 mRNA的表达水平 [A：正常组和0.1μM 组HSP70 mRNA表达水平；B:：PCR扩增产物图示]

在正常细胞中，热休克蛋白作为分子伴侣有促进蛋白质形成构象、恢复已损伤蛋白质的正常结构和促进新多肽合成的作用[3]。而活性氧簇可对细胞大分子物质如脂质、DNA和蛋白质造成损伤，乃至影响细胞的功能，所以有效的防护机制对于细胞生存非常重要。HSP参与蛋白质的合成、折叠、装配、转运和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激原的耐受性，增强抗氧化作用，使细胞维持正常的生理功能[4,5]；HSP 70发挥这一作用的机制尚不清楚。已知HSP 70在应激时高浓度地聚集在染色体及核质内，并以特殊的方式与解聚染色质相互作用，防止染色质和mRNA 复合物降解。研究表明[6]，HSP70或其含有羧基端部分的碎片具有保护细胞免受热应激损害的作用，表明HSP70对细胞的抗损伤能力至关重要。研究发现[7,8]热休克预适应对内皮细胞应激反应的早期和延迟均有保护作用，能防止由于ATP 耗竭而导致的内皮细胞肌动蛋白破坏。培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）经热休克预适应后，其HSP70mRNA的表达显著增加，并能对抗随后活性氧簇所致的损害，说明HSP70参与了热休克诱导抗氧化损伤的保护作用。

在应激条件下，生物细胞的应激反应强弱即应激蛋白表达的量是通过一种自稳机制来调节的。HSP70可通过HSF来调节各种应激蛋白的合成，正常情况下细胞内HSP70的含量是有限的，应激强度的增加（如温度的升高）可使其含量升高。HSP70具有多种底物识别结构域和分子伴侣的功能。本研究采用皮质酮干预大鼠主动脉内皮细胞后，观测不同时相点和不同量效点大鼠主动脉内皮细胞热休克蛋白70表达的改变。结果显示：不同浓度（0.1μM、50μM和100μM）的皮质酮干预内皮细胞2 h后，内皮细胞总蛋白中HSP70的含量显示明显增加，皮质酮干预内皮细胞4 h后，各组内皮细胞总蛋白中HSP70的含量达到峰值，其中以0.1μM 组HSP70的蛋白含量增加最为明显。皮质酮干预内皮细胞72 h后，0.1μM组、50μM 和100μ M 组HSP70的蛋白含量仍有少量表达。提示皮质酮可诱导大鼠主动脉内皮细胞HSP70表达，这种诱导作用在4 h达到峰值后随时间延长作用逐渐减弱，至72 h基本消失，体现了皮质酮通过HSP70表达增加参与内皮细胞的保护。

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