长期胆汁反流对大鼠胃黏膜的影响

王学伟 曹勤 唐剑敏

（上海中医药大学附属普陀医院消化内科，＊病理科，上海 200062）

长期胆汁反流对胃和食管黏膜的影响尚不明确。研究［1］发现胆汁反流至胃，甚至食管，十分常见。Dixon等［2］通过病理研究发现，胆汁反流可能与胃窦黏膜肠化生有关。近年来研究［3］发现，胆汁反流不但与反流性食管炎有关，而且可能是Barrett食管的重要病因，还可能与食管腺癌的发生有关［4］。因此，明确长期胆汁反流对胃和食管黏膜的病理影响，具有重要的临床意义。本研究建立模拟人体生理性胆汁反流途径的大鼠模型，观察长期胆汁反流对大鼠胃黏膜的病理影响，通过免疫组化方法研究长期胆汁反流对胃泌素表达的影响，并探讨其在胆汁反流中的作用。

1 资料与方法

1.1 动物和抗体 Sprague－Dawley大鼠，清洁级，雄性，8周龄，体质量250～300 g，购自中国科学院上海实验动物中心。羊抗大鼠胃泌素多克隆IgG抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗羊IgG抗体购自北京中山公司。

1.2 动物模型 大鼠预适应1周，术前禁食24 h，只给予5%葡萄糖液，术前6 h禁葡萄糖液。麻醉采用10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射。上腹正中切口4 cm，于十二指肠胆总管开口下0.5 cm处横断十二指肠、缝合断端，于前胃与腺胃交界2 mm处前胃大弯侧作1 cm切口，距Treitz韧带4 cm远侧空肠系膜对侧作1 cm切口，行胃－空肠吻口。术后24 h禁食，给予5%葡萄糖液，24 h后少量进食饲料，3 d后恢复正常饮食。

1.3 组织病理 模型建立1年后，13只大鼠经10%水合氯醛0.3 mL／100 g腹腔注射麻醉，断头法处死，大鼠胃经10%甲醛固定72 h，石蜡包埋，切片厚度4μm，HE染色。

1.4 免疫组化 切片65℃烘烤1 h，脱蜡、水化，自来水洗10 min，蒸馏水洗2次，蒸馏水浸泡5 min；再将切片放入3%H2O2，室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，自来水洗10 min，蒸馏水洗2次，蒸馏水浸泡5 min；于柠檬酸缓冲液中微波抗原修复15 min，磷酸缓冲液（PBS）洗，5 min×3次；将切片放入正常血清中，室温孵育30 min，以封闭内源性抗原结合位点；加入经PBS 1：100稀释的一抗，4℃孵育过夜；PBS洗，5 min×3次；加入二抗，室温孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入酶标物，室温孵育1 h，PBS洗5 min×3次；加入DAB显色液，显色6 s，自来水洗10 min，苏木素复染20 s，自来水洗5 min，盐酸浸泡1 s，自来水洗5 min，室温晾干，中性树胶封片。

2 结 果

2.1 组织病理 正常1年龄大鼠中，仅少数胃部有轻度慢性炎性反应。胆汁反流1年后，13只大鼠腺胃部腺体增生非常显著，大多数同时伴有腺体显著扩张；长期胆汁反流导致3只大鼠腺体发生异型增生，其中1只出现癌变；胆汁反流大鼠中糜烂和溃疡少见，仅见于3只和1只大鼠。与此类似，肠化生极少见，仅见于1只大鼠（图1）。胆汁反流1年后，13只大鼠前胃部鳞状上皮显著增生，并伴有明显角化，其中7只大鼠在黏膜下层形成巨大的角化珠，更有3只大鼠形成角化囊肿；与腺胃部类似，前胃部肠化生极少见，仅见于1只大鼠；所有胆汁反流大鼠前胃均未见到糜烂或溃疡（图2）。

2.2 免疫组化 正常大鼠胃泌素阳性染色细胞主要分布于腺胃胃窦部上皮内，并且数量较少。胆汁反流1年后，腺胃胃窦部上皮内胃泌素阳性染色细胞显著增生，呈聚集性存在，腺胃胃体部上皮内亦可见胃泌素阳性染色细胞增生（图3）。

图1－1 腺胃腺体增生、扩张

图1－2 腺胃腺体异型增生

图1－3 腺胃腺体癌变

图1－4 腺胃黏膜糜烂

图1－5 腺胃溃疡

图1－6 腺胃腺体肠化生

图2－1 前胃鳞状上皮

图2－2 前胃鳞状上皮角化珠

图2－3 前胃角化囊肿增生、角化

图2－4 前胃鳞状上皮肠化生

图3－1 正常大鼠胃窦胃泌素阳性染色细胞呈单个存在

图3－2 正常大鼠胃体亦有少量胃泌素阳性染色细胞

图3－3 长期胆汁反流大鼠胃窦胃泌素阳性染色细胞增生伴腺体增生

图3－4 胆汁反流大鼠胃体胃泌素阳性染色细胞增生伴腺体增生、扩张

3 讨 论

大鼠的胃由近端的前胃和远端的腺胃组成，前胃黏膜被覆鳞状上皮，与食管相似，腺胃类似于人胃，分为胃体和胃窦。本模型根据Kaminishi等［5］建立的模型而改进，使胆汁通过幽门反流入腺胃，经位于前胃的胃－空肠吻合口流入空肠，整个腺胃保持完整，故类似于人体生理性胆汁反流途径，不仅便于观察胆汁反流对腺胃黏膜的影响，还可观察其对前胃鳞状上皮的影响。

本研究发现，长期胆汁反流导致大鼠腺胃胃体和胃窦小凹上皮增生，与1994年休斯顿会议对反应性胃炎（reactive gastritis，RG）的描述一致［6］。所有大鼠腺胃腺体增生，并呈囊状扩张，与Taylor等［7］和 Mukaisho等［8］的发现一致，提示胃腺体增生、扩张是胆汁反流性胃炎的特征。本模型仅发现1例腺胃癌变，这可能是由于本模型中腺胃是完整的，类似于生理性胆汁反流；而其他模型均将腺胃与空肠吻合，类似于Billroth II手术，胆汁反流强度可能高于生理性反流，因此胃癌发生率高。临床中发现，两种不同类型上皮的交界处易发生肿瘤。在其他模型中，胃癌多发生于腺胃－空肠吻合口周围。有研究者认为，肠化生是胃黏膜的一种适应性改变，当胃黏膜的局部微环境变为类似于肠内环境时，胃黏膜便出现肠化生，以此来减碱性肠液对黏膜的损伤。将带血管蒂的大鼠胃壁瓣分别移植到肠壁上，移植黏膜发生典型的肠化生，pH测定发现移植黏膜的pH＞6，显著高于胃内（一般pH＜4.5）。在腺胃－空肠吻合口周围，胆汁反流强度可能要高于本模型，造成局部黏膜微环境的pH显著升高，因此肠化生发生率较高。本模型中鳞状上皮显著增生，呈乳头状凸起，上皮增生形成角化珠和角化囊肿。本模型尽管胆汁反流长达1年，却仅有1例肠化生，更无腺癌发生。此差异可能与手术方式不同有关。

胆汁反流可导致高胃泌素血症，并通过抑制生长抑素的释放、降低血清生长抑素的水平进一步加重高胃泌素血症；高胃泌素血症又会加重胆汁反流。患者行胆囊切除后6个月，其胃窦黏膜G细胞的数量即有增加，并存在显著的胆汁反流性胃炎和小凹上皮增生，这提示胆汁反流可导致G细胞增生，并引起高胃泌素血症。通过免疫组化方法，我们发现本模型中腺胃胃窦和胃体G细胞显著增生。胆囊收缩素－2（cholecystokinin，CCK－2）受体是胃泌素的特异性受体，主要表达于壁细胞和ECL细胞。我们推测胆汁反流导致G细胞增生，引起高胃泌素血症，在循环胃泌素的作用下，壁细胞上的CCK－2受体被激活并分泌HB－EGF和双调蛋白等生长因子，促进胃上皮增殖，进一步导致异型增生和癌变。

综上所述，我们通过建立模拟人体生理性胆汁反流的大鼠模型发现，长期胆汁反流能导致腺胃腺体增生并发生异型增生和癌变，前胃鳞状上皮亦显著增生，这可能与长期胆汁反流所致的腺胃G细胞增生和高胃泌素血症有关。

［1］ Fein M，Freys SM，Sailer M，et al.Gastric bilirubin monitoring to assess duodenogastric reflux［J］.Dig Dis Sci，2002，47（12）：2769－2774.

［2］ Dixon MF，Mapstone NP，Neville PM，et al.Bile reflux gastritis and intestinal metaplasia at the cardia［J］.Gut，2002，51（3）：351－355.

［3］ Oberg S，Peters JH，DeMeester TR，et al.Determinants of intestinal metaplasia within the columnar－lined esophagus［J］.Arch Surg，2000，135（6）：651－655.

［4］ O′riordan JM，Tucker ON，Byrne PJ，et al.Factors influencing the development of Barrett＇s epithelium in the esophageal remnant postesophagectomy［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（2）：205－211.

［5］ Kaminishi M，Sadatsuki H，Johjima Y，et al.A new model for production of chronic gastric ulcer by duodenogastric reflux in rats［J］.Gastroenterology，1987，92（6）：1913－1918.

［6］ Dixon MF，Genta RM，Yardley JH，et al.Classification and grading of gastritis.The updated Sydney system［J］.The A－merican Journal of Surgical Pathology，1996，20（10）：1161－1181.

［7］ Taylor PR，Mason RC，Filipe MI，et al.Gastric carcinogenesis in the rat induced by duodenogastric reflux without carcinogens：morphology，mucin histochemistry，polyamine metabolism，and labelling index［J］.Gut，1991，32（12）：1447－1454.

［8］ Mukaisho K，Miwa K，Kumagai H，et al.Gastric carcinogenesis by duodenal reflux through gut regenerative cell lineage［J］.Dig Dis Sci，2003，48（11）：2153－2158.