胶体金免疫层析法快速检测牛奶中氟喹诺酮类药物残留

文 / 万宇平 赵正苗 田 甜 汪善良 韩京朋

（北京勤邦生物技术有限公司）

氟喹诺酮（Fluoroquinolones，FQs）类药物是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物[1]。FQs又称吡啶酮酸类药物，属于化学合成抗菌药。该类药物对葡萄球菌、肺炎球菌、某些厌氧菌、支原体等均有效，特别是对绿脓杆菌效果好，几乎适用于临床常见的各种细菌感染性疾病[2，3]。喹诺酮类药物的作用机制是抑制细菌的DNA旋转酶，从而影响DNA的正常形态与功能，阻碍DNA的正常复制、转录、转运与重组，从而产生快速杀菌作用[4]。

FQs长期使用会蓄集到动物体内，从而影响人类的饮食卫生与食品安全。随着FQs的广泛使用，细菌耐药和不良反应也相继发生，主要有过敏、溢血和肾衰等不良反应。此外还有诱发精神病及癫痫患者发病的风险[5，6]。

由于牛奶中的抗生素会影响牛奶的进一步加工，因此许多国家，以及联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）等国际机构都作出规定：奶牛在接受抗生素治疗期间及用药后数日内挤出的乳汁不得用于生产商品乳[7]。尽管如此，仍有不少农场或奶农不顾抗生素的危害，不遵守相关规定，向乳品加工企业提供含有抗生素的原奶。因此，对乳品加工企业来说，抗生素已经是原奶收购环节必不可少的检测项目。胶体金免疫层析技术是20世纪80年代发展起来的一项新技术，具有简便、快速、准确、费用低的特点[8]。本研究以兽医临床上应用较广的FQs作为检测的目标药物，利用胶体金免疫层析方法实现了牛奶中多种FQs残留的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

氯金酸（HAuCl4.4H2O）（分析纯，上海化学试剂有限公司）；恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、达氟沙星、三聚氰胺、磺胺甲氧异恶唑、氯霉素、红霉素、庆大霉素、四环素标准品、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗鼠二抗（Sigma）；硝酸纤维素膜、吸收垫、样品垫、PVC底板（上海金标生物科技有限公司）；包被抗原（FQs-OVA）、恩诺沙星单抗（自制）；牛奶（市售）；其它试剂均为国产分析纯试剂。

电子天平FA2104（上海良平仪器仪表有限公司）；磁力搅拌器90-2（上海振荣科学仪器有限公司）；低速离心机L500（湘仪集团）；数控切条机CT300、连续式划膜仪HM8000（上海金标生物科技有限公司）；分光光度计752S（上海棱光技术有限公司）；生化培养箱DHP-600（天津市中环实验电炉有限公司）；LGJ-50C冻干机（北京四环科学仪器厂有限公司）；Milli-Q Reference纯水仪（美国Millipore）；液相色谱-串联质谱系统（日本岛津）。

1.2 胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100 mL的0.01%氯金酸加入2.5 mL的1%柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水[9]。

1.3 金标抗体制备

在磁力搅拌下，用0.2 mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，抗体按50～100 μg/mL胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述FQs单克隆抗体。继续搅拌混匀30 min， 加入10%BSA，至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置30 min。12000 rpm，4 ℃离心30 min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤2次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的FQs单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50 μg/mL，置4 ℃备用。

1.4 微孔试剂制备

向微孔试剂微孔板中加入100 μL FQs单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70 ℃的条件下，预冻4 h后，再冻干14 h，即可取出，得到冻干有FQs单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。

1.5 试纸条组装

用0.01 mol/L，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液将FQs-OVA偶联物稀释到1 mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于NC膜上的检测线（T线），包被量为1 μL/cm；在距离检测线3 mm处用pH值7.2，0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠二抗稀释到1 mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1 μL/cm。包被完毕后将包被好的NC膜置于37 ℃烘干60 min，取出。将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸两端粘贴有保护膜，手柄端保护膜覆盖在吸水垫上手柄端，反应端保护膜覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线，用数控切条机CT300切割成4 mm宽的试纸条（图1）。

1.6 免疫层析检测步骤

1.6.1 使用前将本试剂条和待检奶样恢复至室温（牛奶样品必须为均匀液体，不能有结块和沉淀）。

1.6.2 从原包装中取出试剂桶，打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记（需在1 h内使用）。检测试剂取出后，需立即盖好试剂桶盖。

1.6.3 吸取待检牛奶样品溶液，用微量移液器移取200 μL于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀。

1.6.4 将标记好的试纸条插入微孔中，印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。

1.6.5 室温（20～25 ℃）孵育5 min后，取出试纸条，判定结果。

图1 试纸条组装模式图

图2 检测结果判断

1.7 检测结果分析

FQs在样品中的含量高于等于试剂条对其最低检测限时，FQs单克隆-胶体金标记物与FQs结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与FQs-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样品在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带（图2）。具体如下：

阳性：当质控线（C）显示一条红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性；

阴性：当质控线（C）显示一条红色条带，检测线（T）同时也显示出一条红色条带，且检测线（T）颜色接近或浅于质控线（C）时，判为阴性；

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条判为无效。

1.8 检测限试验

取阴性牛奶样品，分别添加质量浓度为0、10、20、40 μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星标准品和0、20、40、80 μg/L的依诺沙星、恶喹酸标准品。所用的稀释液为pH值为7.2，0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液。向微孔试剂中滴加200 μL配制好的标准品，混匀，孵育5 min后，将试纸插入检测。

1.9 方法特异性

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将牛奶中常检的其它药物：三聚氰胺、磺胺甲氧异恶唑、氯霉素、红霉素、庆大霉素、四环素按照500 μg/L的质量浓度分别对阴性牛奶进行添加。用试纸条进行检测，每个浓度重复3 次，判断试纸条的特异性。

1.10 试纸条与液相色谱检测比对[10]

1.10.1 液相色谱条件

色谱柱：Inertsil C5-3，5 μm，150 mm ×2.1 mm（内径）或相当者；流动相：0.1%甲酸的乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱（梯度时间表见表1）；流速：300 μL/min；柱温：30 ℃；进样量：30 μL。

1.10.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式；质谱扫描方式：多反应监测；分辨率：单位分辨率。

1.11 重复性试验

取阴性牛奶样品2 份，分别添加质量浓度为0、20 μg/L的恩诺沙星，将添加的牛奶各用10 支试纸条进行重复检测，观察检测结果是否一致。

1.12 稳定性试验

稳定性试验分为37 ℃加速试验和4 ℃保存试验，将制备好的试纸条置于37 ℃进行加速试验，分别在7、14、28、56、112 天取出进行检测，每次3组，每组10 个平行，分别以质量浓度为0、10、20 μg/L的恩诺沙星标准品添加的阴性牛奶进行检测，观察颜色的变化。将制备好的试纸条置于4 ℃下进行试验，分别在1、3、6、9、12、15 个月取出进行检测，每次3 组，每组10 个平行，以质量浓度为0、10、20 μg/L的恩诺沙星标准品添加的阴性牛奶进行检测，观察颜色的变化。

表1 梯度洗脱条件

图3 紫外扫描胶体金结果

图4 胶体金与待标记蛋白质比例确定

图5 微孔试剂示意图

2 结果与分析

2.1 胶体金质量鉴定结果

制备好的胶体金外观纯净、透亮，无沉淀和漂浮物。将胶体金溶液用紫外/可见光分光光度计在可见光范围（400～600 nm）扫描，得到单一的吸收峰，最大吸收峰波长为525 nm（图3）。

2.2 金标抗体和微孔试剂

胶体金是一种带负电荷的疏水性颗粒，未加抗体或加入的抗体量不足以稳定胶体金时，由于盐离子效益，加入氯化钠时，会改变胶体金的性质，出现由红变蓝的聚沉现象（图4）；反之，加入足够多抗体足以稳定胶体金，则不会发生聚沉现象。以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，制备金标抗体，并加入微孔板中，通过冷阱冻干，制备微孔试剂（图5）。

2.3 检测限

结果显示：添加0、10 μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星和0、20 μg/L的依诺沙星、恶喹酸的牛奶，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；添加20、40 μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星和40、80 μg/L的依诺沙星、恶喹酸的牛奶，试纸条质控区显色，但检测区不显色，呈阳性。

因此，可以认为，本试剂条对恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星检测检测限为20 μg/L，对依诺沙星、恶喹酸检测检测限为40 μg/L。

2.4 特异性

结果显示：三聚氰胺、磺胺类药物、氯霉素、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、四环素类药物在500 μg/L浓度时，试纸条质控区和检测区均显色，可以得出本试剂条未对这些药物发生交叉反应。

表2 试纸条检测结果与仪器方法检测结果比较 单位：µg/L

表3 37 ℃加速试验结果

表4 4℃保存试验结果

2.5 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）法比对结果

抽取阴性牛奶样品20份，随机抽取5份，添加质量浓度为20 μg/L的恩诺沙星，分别用本试纸条方法和仪器方法检测，结果见表2。结果显示，试纸条的检测结果与仪器检测结果一致，氟喹诺酮类药物残留检测试纸条的检测结果稳定可靠。

2.6 重复性试验

将添加浓度为0μg/L的牛奶用试纸条重复检测发现，试纸条的检测线均显色，且深浅大致一致，而添加浓度为20μg/L的牛奶，检测线均未显色。试纸条对牛奶样品检测的假阳性率和假阴性率均为0，表明本试验制得的试纸条重复性较好。

2.7 稳定性试验

稳定性决定试纸条的有效期限。为了检测试纸条的稳定性，分别进行37 ℃加速试验和4 ℃保存试验，其中37 ℃加速试验结果如表3所示，4℃保存试验结果如表4所示。结果表明，氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸条在4 ℃条件下可以保存12 个月。

3 结论

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过肉眼观察以及紫外扫描，确定所制备的胶体金颗粒均一，平均直径为40 nm。以胶体金标记抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体，建立胶体金免疫层析法快速检测氟喹诺酮类药物残留方法，试纸条对牛奶中恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星检测检测限为20 μg/L，对依诺沙星、恶喹酸检测检测限为40 μg/L，可用于牛奶中11 种氟喹诺酮类药物残留检测。该方法能够满足日本、欧盟、加拿大和美国对氟喹诺酮类药物在牛奶中最高残留限量检测的要求[11，12]。试纸条检测线颜色明显浅于空白对照，通过目测即可直接判定结果。该方法具有样品前处理方法简便，检测时间短，灵敏度高的特点，而且与其它药物无交叉反应，特异性良好，假阳性率和假阴性率均为0。经LC-MS/MS法验证，试纸条检测结果稳定可靠。另外，该方法所用试剂均无毒、无污染，可用作牛奶中氟喹诺酮类药物残留检测的快速定性筛选，但对于阳性结果需用其它方法进一步确认。

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