表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

焦同路，王靖飞，赵双成，王世达，常晓飞，田 石，柳金雄，李雁冰，姜永萍*，陈化兰*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与技术服务中心，黑龙江哈尔滨 150001）

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的主要流行于鸡群中的烈性传染病。根据AIV表面糖蛋白HA和NA抗原性的差异可以将其分为16个HA亚型和9个NA亚型，其中H5N1亚型属于高致病AIV。1996年在广东省分离出中国境内第一株高致病性的H5N1 AIV（A/goose/Guangdong/1/96），随后在中国的南方地区又分离出多株H5N1 AIV[1]，其中1997年在香港分离的一株H5N1 AIV能够感染人并致死[2]。据统计2004~2008年期间中国共暴发104次H5N1 AIV引起的禽流感[3]，对禽类养殖业和公共卫生安全造成了严重的威胁。目前中国的禽流感防制主要是采取捕杀并结合疫苗免疫的策略。

AI防制的疫苗主要有灭活疫苗和重组病毒活载体疫苗，但灭活疫苗的应用不利于疫情的监测，而重组病毒活载体疫苗则可避免这一不足，因此重组病毒活载体疫苗成为研究的热点。禽痘病毒（FPV）具有广泛的宿主嗜性，持续感染的时间比较长，能承载大片段外源DNA等优点，已成功用于多种病原基因的表达[4-6]。一些报道表明插入流感病毒HA基因的重组FPV对家禽具有良好的免疫保护效果[7-9]，但随着流感病毒的变异，原有的疫苗不能对一些变异株提供有效的免疫保护。本实验利用含有gfp和gpt的双筛选标记的转移载体pSY681-gfp-gpt[10]，将流行于我国南方水禽的H5N1 AIV代表株A/Duck/Anhui/1/06（H5N1）（简称AH/06）的HA基因同源重组到FPV中。构建了表达HA蛋白的重组禽痘病毒（rFPV-gpt-gfp-AHHA），为进一步的免疫效力研究提供了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株和细胞 鹌鹑源FPV（CVCCAV1003）、含有AH/06 HA基因的重组质粒pMD-HA和转移载体pSY-681-gfp-gpt均由本研究所农业部动物流感重点实验室保存；CEF由本研究所实验动物中心提供的9日龄SPF鸡胚制备。

1.2 主要试剂 FuGENE HD Transfection Reagent购自罗氏公司；Mycophenolicacid、Xanthine、Hypoxantine购自Sigma公司；rTaqDNA聚合酶、NotⅠ、AflⅡ、Phusion DNA Polymerase、T4DNA连接酶购自NEB公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗鸡IgG（IRDyeR800）购自Rockland公司；感受态细胞JM 109购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 转移载体构建 pSY681-gfp-gpt-AHHA的构建根据AIVAH/06 HA基因的ORF区设计一对引物，并且在上游引物的5'端加入酶切位点AflⅡ和kozak序列（5'-CGCTTAAGGCCGCCACCATGGAGAAAATA GTGCTT-3'），下游引物的5'端加入酶切位点NotⅠ（5'-CTAGCGGCCGCTTAAATGCAAATTCTGC-3'），以pMD-HA为模板用Phusion DNA Polymerase扩增HA基因的ORF片段。将其采用NotⅠ、AflⅡ分步酶切后回收，用T4连接酶连接到经同样酶切的pSY681-gfp-gpt中得到pSY681-gfp-gpt-AHHA。

1.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA的构建与筛选 参照文献方法用FPV感染CEF，感作2 h后弃去病毒液。按照FuGENE HD转染试剂的说明书将pSY681-gfpgpt-AHHA转染于FPV预感染的CEF中，在37℃5%CO2条件下培养至出现细胞病变（CPE）时收获细胞，反复冻融3次后用于筛选。首先利用标记基因gfp表达的绿色荧光蛋白在荧光显微镜下挑取荧光蚀斑进行几轮筛选，待大部分蚀斑呈现绿色荧光时，同时利用双重筛选标记gfp和gpt在含低熔点琼脂糖的培养液中加入霉酚酸（25μg/mL）、次黄嘌呤（15μg/mL）、黄嘌呤（250μg/mL）以抑制残留野生病毒的增殖，经过几轮筛选后得到完全纯化的含有双标记基因和HA基因的rFPV-gfp-gpt-AHHA。

1.5 rFPV-gfp-gpt-AHHA的鉴定及HA基因表达产物的western blot鉴定 收集重组病毒感染后病变的 CEF，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒提取其总DNA，以其为模板用特异性引物进行PCR扩增。同时收集病变的细胞反复冻融后超声裂解，进行SDS-PAGE电泳，并转移到NC膜上。以AIV AH/06的特异性多克隆血清为一抗（1∶200），以兔抗鸡 IgG（IRDyeR800）为二抗，鉴定 rFPV-gfp-gpt-AHHA表达的HA蛋白的抗原活性。

1.6 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生长曲线比较将纯化的rFPV-gfp-gpt-AH-HA和亲本FPV分别以0.1 MOI量感染CEF，在37℃ 5%CO2条件下培养。分别于接毒24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后收获病毒反复冻融3次后测定PFU，绘制生长曲线。

2 结果

2.1 转移载体pSY681-gfp-gpt-AHHA的鉴定 以pMD-HA为模板进行HA基因的扩增，得到大小约为1 700 bp的ORF片段，将其克隆到到约为8 000 bp的转移载体pSY681-gfp-gpt中。PCR鉴定pSY681-gfp-gpt-AHHA，结果显示目的条带的大小与理论值相符（图1）；NotⅠ、AflⅡ双酶切的结果也显示得到的两条目的条带与HA基因的ORF片段及转移载体pSY681-gfp-gpt的理论值相符（图1）。

2.2 rFPV-gfp-gpt-AHHA的纯化与扩增 将pSY681-gfp-gpt-AHHA转染于预感染FPV的CEF中进行同源重组，利用双筛选标记gfp和gpt纯化rFPV-gfpgpt-AHHA。首先利用gfp筛选标记对转染后收获的病毒进行几轮筛选，至大部分病毒蚀斑在荧光显微镜下呈现绿色荧光时，再用gfp和gpt双重筛选标记进行几轮筛选，最后得到纯化的rFPV-gfp-gpt-AHHA。用rFPV-gfp-gpt-AHHA感染CEF，待细胞病变后荧光显微镜下观察，所有的病毒蚀斑均呈现绿色荧光（图 2），反复冻融病变的 CEF收获增殖的 rFPV-gfp-gpt-AHHA。

2.3 rFPV-gfp-gpt-AHHA的PCR鉴定及HA基因表达产物的western blot鉴定 以提取的重组禽痘病毒的总DNA为模板，用特异性引物进行PCR鉴定，结果得到大小约为1 700 bp的条带，并与理论值相符（图3），同时测序的结果也显示rFPV-gfp-gpt-AHHA中插入了HA基因的ORF片段并且没有发生氨基酸突变。用特异性多克隆血清进行的western blot鉴定也表明rFPV-gfp-gpt-AHHA能够稳定的表达HA 蛋白（图 3）。

2.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生长曲线 病毒在不同生长点的蚀斑结果显示rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV在正常条件下培养96 h后病毒滴度达到最大值，两者之间生长情况基本一致（图4）。生长曲线表明外源基因的插入并没有影响亲本FPV的复制，rFPV-gfp-gpt-AHHA能够稳定的复制。

3 讨论

针对AIV，具有免疫保护性的蛋白主要是HA、NA和NP，但由于抗NA的抗体不能够中和病毒，而NP蛋白在体内诱导的免疫原性还不足以对致死攻击提供有效的保护[11]，所以HA蛋白是目前流感亚单位疫苗和重组活载体疫苗的主要免疫性抗原。

图4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生长曲线Fig.4 One-step growth curve for rFPV-gfp-gpt-AHHA and FPV

乔传玲等将AIV A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）的HA基因同源重组到亲本痘病毒S-FPV-017中，构建的重组禽痘病毒活载体疫苗自2005年起开始在中国部分地区投入使用并取得良好的效果[9]，但为了应对AIV重组变化可能带来的抗原漂移，本实验选取了流行于我国南方水禽中的H5N1高致病性禽流感抗原群的代表株AH/06的HA基因进行同源重组，制备新一代的痘病毒活载体流感疫苗。重组禽痘病毒的筛选和纯化工作是本实验的关键点，实验显示由于原代细胞转染效率比较低，因此在重组禽痘病毒最初几代的筛选过程中不能利用gpt筛选标记进行药物压力筛选，以防重组禽痘病毒的丢失。本实验中我们首先利用gfp标记进行多轮筛选后，再同时利用gfp和gpt双重筛选标记进一步的纯化重组禽痘病毒。同时为提高HA蛋白的表达量本实验在HA基因的起始密码子之前加入了Kozak序列。

本实验构建了能够稳定复制的rFPV-gfp-gpt-AHHA，并对其表达的HA蛋白进行了western blot验证，表明了rFPV-gfp-gpt-AHHA表达的HA蛋白具有良好的抗原活性，为进一步的免疫效力研究奠定了基础。

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