四氢生物蝶呤对大鼠低密度脂蛋白氧化修饰的作用及其机制探讨*

朱宝亮,赵 颖,刘 景,葛 凤△,刘树玲,王俊杰,刘梅芳,颜 红

(1.济宁医学院生理学教研室,2.生化教研室,3.药学院,山东 日照 276826)

在遗传或环境等诸多动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)易患因素中,血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平升高是惟一不需要其他危险因素协同而足以诱发和推进AS发生、发展的危险因素。LDL在体内被氧化修饰为氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,Ox-LDL)后引发的一系列复杂的病理生理过程,在AS进程中起着重要作用[1]。Ox-LDL氧化修饰是一个复杂的过程,其机制尚未充分阐明。内皮细胞表面一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)关键辅因子四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)被氧化分解后,NOS脱偶联,产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成机体氧化应激状态[2]。高脂血症(hyperlipidemia,HL)也是一种氧化应激环境。本实验旨在探讨HL氧化应激在NOS脱偶联中的作用及其在LDL氧化修饰中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组和处理

选用8周龄雄性Wistar大鼠54只,随机分为对照组、高脂饮食组(HL组)和高脂饮食并腹腔注射BH4组(HL+BH4组)(n=18)。HL+BH4组每周2次腹腔注射BH41 mg/kg,对照组注射等容量生理盐水,于实验前、实验8周和16周时各取6只上述三组大鼠,心脏穿刺取血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL和蝶呤水平。断头处死,取胸主动脉再分别进行主动脉匀浆ROS、过氧化脂质水平测定。

HL大鼠模型饲料的组成是:1%胆固醇、5%猪油、10%鸡蛋黄粉、84%基础饲料;对照组大鼠进食标准大鼠饲料。大鼠每6只一笼,饲养在室温(25±1)℃和人工光照明暗各12 h的饲养室内。各组均自由饮水。

1.2 血脂 、BH4、ROS、LDL 氧化修饰程度和脂质过氧化水平测定

1.2.1 血清TC、TG和LDL测定 全血3 000 r/min离心后取血清,用日立7170型全自动生化分析仪检测TC、TG 和LDL。

1.2.2 LDL氧化修饰程度测定 以硫代巴比妥酸反应物(TBARS)生成量代表LDL的氧化修饰程度。取0.1 ml血清与 0.67%TBA 1.0 ml和 10%TCA 1.0 ml混合后置沸水浴15 s,4 000 r/min离心25 min,取上清于波长为532 nm处测吸光度值,以标准的四乙氧基丙烷计算含量,结果以上清液中含有的mmol/L TBARS量表示。

1.2.3 动脉过氧化脂质含量测定 用过氧化脂质的代谢终产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量表示。取大鼠主动脉血管段剪切成小块并称重,取50 mg组织放入300 μ l氧饱和的 20℃Krebs液中制成匀浆,离心取上清,按MDA试剂盒说明(硫代巴比妥酸法)用722分光光度计在532 nm处测定每管中硫代巴比妥活性物含量,再根据公式计算MDA的含量。

1.2.4 BH4及其氧化产物BH2和B的测量 取大鼠主动脉血管段剪切成小块并称重,取50 mg组织放入 300 μ l预冷的提取液 50 mmol/L Tris HCl(pH 7.4),1 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA中进行研磨,离心收集上清并测定蛋白含量,然后加入等体积比的1.5 mol/L HClO4和2 mol/L H3PO4析出蛋白,离心弃去蛋白,取上清;先在酸性条件下氧化:加10 μ l 1%碘液(2%KI配制)混匀,避光置于室温60 min,取部分标本待测;然后于碱性条件下氧化:加入10 μ l NaOH,再加入 10 μ l 1%碘液混匀,避光置于室温60 min;加入 20 μ l H3PO4酸化标本,离心收集上清。使用高效液相色谱法分别对酸性条件下氧化和碱性条件下氧化的标本进行测定。酸性条件下氧化的标本检测出总生物喋呤(TB)包括BH4、BH2(二氢生物喋呤)和B(生物喋呤);在碱性条件下氧化的标本可以检测出BH2和B;将BH2和B从总生物喋呤中除去,就是BH4含量。

1.2.5 动脉壁ROS测定 取长2 mm的主动脉环三段,放置在特制的缓冲液中。缓冲液的成分(mmol/L)包括:145 NaCl,4.86 KCl,5.7 NaH2PO4,0.54 CaCl2,1.22 MgS04,5.5葡萄糖,0.1去铁敏和1 U/μ l过氧化氢酶。最后加入细胞色素丙(50 μ mmol/L;Sigma C-4186,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)。分别在过氧化物歧化酶(SOD,125 U/ml)存在和不存在的情况下放置在37℃的恒温箱中60 min。在550 nm处计算细胞色素丙的吸收量,校正背景波长540和560 nm。根据在SOD存在和不存在的条件下细胞色素丙吸收量的不同计算ROS水平。

1.3 统计学分析

采用Prism软件分析和处理相关数据实验结果用均数±标准差(±s)表示,用t检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 大鼠血清TC、TG和LDL水平

实验前三组大鼠的血清TC、TG和LDL水平无明显差异(P＞0.05)。至实验8周和16周时,HL组和HL+BH4组血清TC、TG和LDL水平较对照组均明显升高(P＜0.01),但HL组和HL+BH4组之间无明显差异(P＞0.05,图1)。

2.2 大鼠动脉匀浆ROS水平分析

实验前三组大鼠动脉匀浆ROS水平无明显差异(P＞0.05)。至实验8周和16周时,HL组和HL+BH4组匀浆液中 ROS水平均明显升高(P＜0.01);升高幅度以HL组最为明显,实验8周时升高186%,16周达189%。和HL组相比,实验8和24周时HL+BH4组大鼠匀浆液中的ROS水平均明显降低(P＜0.01),降低幅度分别为41%和39%(图2)。

Fig.1 Changes of TG,TC and LDL in HL rats after treating with BH4

Fig.2 Changes of ROS in HL rats after treating with BH4 ROS:Reactive oxygen species;HL:Huperlipidemia;BH4:Tetrahydr-obiopterin

2.3 大鼠动脉匀浆BH4水平变化

实验前三组BH4和TB水平无明显差异(P＞0.05)。至实验8周和16周时,HL+BH4组较对照组和HL组BH4水平均明显升高(P＜0.01),提示给予外源性BH4有效提高了动脉中BH4含量;与对照组相比,HL大鼠主动脉血管匀浆中BH4含量明显降低(P＜0.01),但总喋呤水平(TB=BH4+BH2+B)无明显差异(P＞0.05),说明HL增加了BH4的氧化(图3)。

2.4 BH4对大鼠血清Ox-LDL氧化修饰程度的影响

实验前三组血清TBARS生成量(间接反映Ox-LDL氧化修饰程度)无明显差异(P＞0.05)。至实验8和16周时,HL组和HL+BH4组均较对照组明显升高(P＜0.01)。与对照组相比,HL大鼠血清中TBARS生成量随着周龄的增加有逐渐升高的趋势,在16周龄升高幅度为22%,至24周龄增至43%。和HL组相比,上述HL+BH4组大鼠于实验8周和16周时血清中TBARS生成量明显降低(P＜0.01,图4),说明BH4有阻止LDL氧化修饰的作用。F

Fig.3 Changes of BH4and TB in HL rats after treating with BH4 TB:BH4+BH2+B;BH4:Tetrahydrobiopterin

ig.4 Changes of Ox-LDL in HL rats after treating with BH4 LDL:Low density lipoprotein;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahy drobiopterin

2.5 HL大鼠动脉血管壁丙二醛水平变化

实验前三组大鼠主动脉匀浆中的MDA水平无明显差异(P＞0.05)。至实验8周和16周时,HL组(7.43±1.24;8.24±1.37μ mol/L)和 HL+BH4组(6.42±0.63;7.10±0.86μ mol/L)血清MDA 较对照组(2.26±0.28;2.39±0.43μ mol/L)明显升高(P＜0.01),但HL+BH4组较HL组MDA明显降低(P＜0.01),说明BH4有降低动脉血管中MDA的作用(图5)。

Fig.5 Changes of MDA in HL rats after treating with BH4 MDA:Malondialdehyde;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahydrobiopterin

3 讨论

AS是全世界危害人类生命健康最严重的疾病之一,其患病率和死亡率均居各类疾病之首。LDL在体内被氧化修饰为Ox-LDL后引发的一系列的复杂病理生理改变是AS氧化应激学说的核心内容。Ox-LDL进入内皮细胞下组织后,不断被内皮细胞和进入内皮下的单核细胞和巨噬细胞进一步氧化修饰为氧化程度更高的Ox-LDL—Hox-LDL(highly oxidized LDL)。Hox-LDL再被巨噬细胞吞噬,最终形成脂肪纹[3]。但内皮细胞等氧化修饰LDL的机制尚未阐明。

内皮细胞膜的穴样凹陷中含有大量的NOS。BH4是NOS的关键辅因子,当BH4充足时,NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO);而当BH4水平不足时,NOS催化L-精氨酸氧化不是生成NO,而是.O2-,此种现象称为NOS脱偶联[4]。NOS脱偶联产生超氧阴离子(.O2-)在LDL氧化修饰中的作用尚不清楚。

已经证明,当LDL水平增高时,机体处于氧化应激状态[5]。在LDL氧化过程中,氧自由基攻击LDL中不饱和脂肪酸上的双键,使之发生断裂,先形成不饱和脂肪酸自由基,再氧化成脂过氧基,后者是一种强氧化剂[6]。

BH4是一种还原剂,易被氧化为BH2和B,即失去活性[7]。为了研究脂过氧基对NOS脱偶联的影响,即脂过氧基对NOS的关键辅因子BH4的氧化作用,我们检测了高脂血症大鼠血清中BH4及其氧化代谢产物BH2和B的水平。结果表明,在HL大鼠实验8和16周两个研究时点,HL组大鼠血清中BH4水平明显降低,而总蝶呤水平并无明显差别。提示HL增加了机体BH4的氧化,其原因我们推测可能与HL时脂过氧基增多造成的氧化应激环境有关。而给予外源性的BH4有效提高了HL大鼠血液BH4的水平。

既然HL时,BH4低于正常,NOS脱偶联,那么血液中ROS的生成量一定增多,为了研究NOS脱偶联在HL氧化应激中的作用,本实验测定了HL大鼠血清中ROS水平,结果表明在实验8和16周时,ROS水平比对照组分别增高186%和189%,说明BH4降低导致的NOS脱偶联在HL氧化应激状态的形成有着重要作用。而对HL组大鼠使用BH4治疗,其动脉匀浆液中的ROS水平明显降低(P＜0.01),实验8和16周时降低幅度分别达到41%和39%,进一步说明上述作用的存在。

本实验还观察了通过补充BH4,纠正NOS脱偶联对HL大鼠脂质过氧化的影响。脂过氧基代谢生成过氧化脂质,最终大部分生成丙二醛。因此我们采用观察丙二醛的方法,间接了解机体过氧化脂质的水平。至16周以后,HL组和HL+BH4组血清MDA较对照组明显升高,但HL+BH4组较HL组MDA明显降低,说明BH4有降低动脉血管中MDA的作用。其机制可能是外源性的BH4纠正NOS脱偶联,ROS生成减少,而后者降低了LDL脂质过氧化。

高脂血症的主要特征是血液中的LDL水平明显增高,但血液中 LDL氧化修饰的程度并不高。LDL是一个逐渐氧化修饰的过程[8]。即LDL与内皮接触以及进入内皮下间隙时其氧化程度不断增高。既然高LDL时,脂质过氧化增强和NOS脱偶联,机体处于氧化应激状态,血液或动脉壁中的ROS和脂过氧基水平均明显增高。二者结构中均存在游离的电子,是强氧化剂,因此它们在LDL氧化修饰中的作用应是一个值得探讨的课题。我们的研究表明,HL大鼠血清中TBARS生成量随着周龄的增加有逐渐升高的趋势,升高幅度在16周龄时为22%,之后幅度升高逐渐增加,至24周龄增至43%。而给予外源性的BH4,纠正HL大鼠NOS脱偶联,血液中的Ox-LDL氧化修饰程度明显降低,提示NOS脱偶联在LDL氧化修饰过程中具有重要作用。

综上所述,我们做如下推理:当血液中具有一定氧化程度的Ox-LDL与内皮细胞接触时,其中的脂过氧基氧化内皮细胞膜NOS中的BH4,NOS脱偶联,产生大量的ROS,并继续生成大量的脂过氧基。ROS和脂过氧基使Ox-LDL氧化修饰为Hox-LDL,并进一步氧化BH4,加重NOS脱偶联,造成恶性化的氧化应激,这可能是LDL在内皮细胞表面氧化修饰的机制。

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