虎杖提取物对CCl4致建鲤肝损伤抗氧化系统的影响

杜金梁，贾 睿，曹丽萍，殷国俊

(中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081)

肝损伤是多因素参与的复杂过程，自由基和脂质过氧化反应在肝损伤及肝疾病中起着十分重要的作用[1]。有研究表明，虎杖对过氧化脂质具有清除作用，对肝细胞有保护作用。虎杖煎剂具有改善损伤肝组织的微循环，抑制白细胞、血小板与肝脏内皮细胞的粘附，达到促进肝细胞再生、修复损伤的能力[2－3]。虎杖为蓼科植物虎杖的根茎，含有多种药理活性成分，其主要有效成分为黎芦醇苷，具有扩血管、抗血辁、抗休克、降血脂及抗氧化等作用;另外，虎杖还具有抗菌、抗病毒及保肝等作用[4－6]。目前关于虎杖的研究在水产上未见有相关报道，本实验研究了不同剂量的虎杖提取物对CCl4致建鲤急性肝损伤的影响，以期为筛选鱼类保肝药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼 试验用建鲤取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心渔场，体质健康、无伤，体质量为30 g左右。将建鲤饲养于循环水系统中，培养水温为25℃，每天投喂2次饲料。

1.1.2 试剂和仪器 虎杖提取物，购自南通四海植物精华有限公司;LDH、GPT、GOT、TP、ALB，SOD、GSH-Px、MDA、CAT、T-AOC均购自南京建成生物工程有限公司;723型分光光度计，购自上海欣茂仪器有限公司。

1.1.3 饲料配制 试验日粮为基础日粮，鱼粉8%、豆饼20%、棉籽饼20%、米糠20%、麸皮21%、土面3.5%、槐叶粉6%、骨粉1%、食盐0.5%。粗蛋白为30.3%，粗脂肪为6.4%，粗灰分7.1%。各种原料分别粉碎过60目筛，先把鱼粉、土面、食盐等混匀，再加大料逐级充分混匀，后加适量水，用小型绞肉机制成粒径2.0 mm的湿颗粒饲料，晾干备用。在基础日粮中分别添加质量分数为0.5%和1%的虎杖提取物。

1.2 方法

1.2.1 试验组别划分及处理 选取体质健康、无伤，体质量为30 g左右的建鲤120条，随机将建鲤设5个处理组，1个对照组，每组20条。每日饲喂2次，按体质量的2%来确定饲喂量，连续饲喂8周。I(CCl4)组:只饲喂基础饲，连续饲喂8周后，按建鲤体质量每10 g注射0.05 mL标准体内注射30%CCl4(溶于植物油中);II、III(0.5%虎杖提取物、1%虎杖提取物)组:分别在基础日粮添加0.5%、1%虎杖提取物，连续饲喂8周后，按建鲤体质量每10 g注射0.05 mL标准体内注射CCl4;IV、V(0.5%虎杖提取物、1%虎杖提取物)对照组:分别在基础日粮添加0.5%、1%虎杖提取物，连续饲喂8周后，不进行体内CCl4注射，按体质量每10 g注射0.05 mL标准进行植物油注射;VI(空白对照)组，只饲喂基础日粮，连续饲喂8周后，按体质量每10 g注射0.05 mL标准进行植物油注射。

1.2.2 CCl4诱导肝损伤模型的建立 连续饲喂8周，停止饲喂，然后进行造模实验。实验分为空白对照组(control)和CCl4组，CCl4设4个浓度梯度(12.5%、25%、30%和50%的CCl4-植物油混合溶液)，每条鱼以5 mL/kg的剂量腹腔注射CCl4和植物油，在注射后24、48、72、96、120和144 h分别采血和肝脏组织，测定血清中GOT、GPT、LDH，每组10条鱼。由于50%的CCl4会造成鱼致死，因此不进行结果分析。

1.2.3 样品采集及制备 分别于建鲤尾静脉采集血液2 mL，3 000 r/min离心15 min来分离血清，于－20℃条件下保存备用。采集建鲤肝脏，将肝脏用生理盐水冲洗，除去血液，滤纸吸干，称取0.1 g加9倍生理盐水，剪碎后置玻璃匀浆机中研成10%的组织匀浆，2 000 r/min离心10 min，取上清液于－20℃条件下保存备用。

1.2.4 肝组织中SOD、GSH-Px、MDA、CAT、T-AOC的测定 取匀浆后上清液按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作方法进行各项指标测定。

1.2.5 血清中LDH、GPT、GOT、TP、ALB的测定 取建鲤血清，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作方法进行各项指标测定。

1.2.6 统计学处理 所有数据均用SPSS17.0软件包进行处理。采用One-Way ANOVA检验法进行显著性分析，结果以平均值±标准误表示，对样本间进行t检验，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

图1 CCl4对鲤鱼血清中GPT、GOT和LDH的影响Fig.1 Effects of CCl4on activity of GPT，GOT and LDH in seurum of carps

2 结果与分析

2.1 不同浓度的CCl4对鲤鱼血清中GPT、GOT和LDH活性的影响

由图1可知，血清中GPT、GOT和LDH含量随着CCl4浓度的增大而升高。与空白对照(control)组相比，12.5%的CCl4对3种酶活性影响差异不显著(P＞0.05);25%的CCl4在24、48和72 h极显著提高了GPT和GOT的溢出量(P＜0.01);30%的CCl4在24、48和72 h显著的提高了GPT、GOT和LDH在血清中的含量(P＜0.05或P＜0.01)。在96、120和144 h采集的血清中这3种酶活性其含量也有所升高，但与对照组相比没有显著性差异。

2.2 建鲤血清中LDH、GPT、GOT活性的测定结果

由表1可知，CCI4造模组GPT、GOT、LDH活性显著升高，GOT、LDH活性与对照相比，差异极显著(P＜0.01);GPT活性与空白对照组相比，差异显著(P＜0.05)。不同浓度的虎杖提取物均可以降低血清中GPT、GOT、LDH的活性，与CCI4组相比，0.5%的虎杖提取物保肝效果最明显;与空白对照组相比，0.5%的虎杖提取物差异不显著(P＞0.05)。而0.5%和1%虎杖提取物对照组则无明显变化。

表1 不同浓度虎杖提取物对建鲤血清中LDH、GPT、GOT活性的影响(n=10)Tab.1 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the content of serum LDH、GPT、GOT in Jian Carp(n=10)

2.3 建鲤血清中TP、ALB活性和肝组织中抗氧化酶指标T-AOC、CAT的测定结果

由表2可知，CCl4造模组TP、ALB活性显著下降，与空白对照组相比，差异显著 (P＜0.05)。不同浓度的虎杖提取物对于抗CCl4诱导的肝损伤有显著效果，能显著增加TP、ALB活性。与CCl4组相比，0.5%和1%虎杖提取物组差异显著，以1%的虎杖提取物组效果最佳。与空白对照组相比，1%的虎杖提取物差异不显著(P＞0.05)。而0.5%和1%虎杖提取物对照组则无明显变化。

表2 不同浓度虎杖提取物对建鲤血清中TP、ALB活性和肝组织中T-AOC、CAT的影响(n=10)Tab.2 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the content of serum TP、ALB and on the antioxidant indexes of liver tissue T-AOC、CAT in Jian Carp(n=10)

由表2还可知，CCl4造模组T-AOC和CAT含量均显著下降，与空白对照组相比，差异显著(P＜0.05)。当不同浓度虎杖提取物作用于肝组织时，1%的虎杖提取物能显著提高CAT含量，与CCl4造模组相比，差异极显著(P＜0.01);与空白对照组相比，差异不显著(P＞0.05);而0.5%和1%虎杖提取物对照组则无明显变化。

2.4 肝组织中抗氧化酶指标SOD、GSH-Px、MDA的测定结果

由表3可知，CCl4造模组SOD、GSH-Px显著下降，MDA活性显著增加，与Control组相比，差异显著(P＜0.05)。当不同浓度虎杖提取物作用于肝组织时，1%的虎杖提取物能显著提高SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，与空白对照组相比，差异不显著(P＞0.05);与CCI4组相比，差异显著 (P＜0.05);而0.5%和1%虎杖提取物对照组则无明显变化。

3 结论与讨论

CCl4所造成的肝损伤模型是比较经典的化学性肝损伤动物模型，被广泛应用到哺乳动物上面[7－8]，但是关于水产上面CCl4所造成的肝损伤研究却不多见，本实验室利用CCl4已成功制备了建鲤肝损伤模型，为水产上面研究肝损伤奠定了基础。在本实验中通过将不同浓度CCl4作用肝组织不同的时间段，建鲤血清中GPT、GOT和LDH的含量有不同程度的升高。当CCl4浓度达到25%和30%时，随着时间的延长，3种酶的溢出量极显著的上升，与空白对照组相比差异极显著(P＜0.01)，当作用时间超过72 h时，CCl4的损害程度有变弱趋势，3种酶在血清中的看量渐渐恢复正常。因此急性肝损伤模型的时间选择在72 h之内。

表3 不同浓度虎杖提取物对建立建鲤肝组织中抗氧化酶指标SOD、GSH-Px、MDA的影响(n=10)Tab.3 Effects of different concentrations of polygonum cuspidatum extract on the antioxidant indexes of liver tissue SOD，GSH-Px，MDA in Jian carp(n=10)

有资料表明CCl4所致肝损伤是典型的脂质过氧化损伤，可引起脂质过氧化，使肝细胞损伤，转氨酶从受损的肝细胞内溢出，使血清中转氨酶升高[9－10]。在生理情况下，生物体内氧自由基虽然不断地产生，但也不断地被清除。但是在某些病理情况下，由于机体清除氧自由基产生过多，引起氧自由基含量升高，导致组织损伤而发生疾病。MDA是脂质过氧化的主要降解产物，其含量的大小可以间接反映自由基对组织的破坏程度。MDA通常和SOD或者GSH-Px联合使用，一起反映氧自由基对细胞的损伤程度。在本实验中，CCl4造模组SOD、GSH-Px显著下降，MDA活性显著增加，与空白对照组相比，差异显著(P＜0.05)。当不同浓度虎杖提取物作用于肝组织时，1%的虎杖提取物能显著提高SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量，说明1%的虎杖提取物对于清除氧自由基方面作用显著，对于防治肝损伤有很好的效果。

GOT与GPT是反映肝病变情况最敏感的指标，当机体组织受到损伤时，血清中转氨酶含量会升高，而血清转氨酶的升高反映了肝细胞受到损伤，其高低大小同时也反映了损伤程度。乳酸脱氢酶(LDH)在体内广泛分布但缺乏特异性，当发生肝病时其同工酶LDH5增高显著。本试验中由CCl4诱导的肝组织损伤GOT、GPT与LDH含量显著升高，尤其是GPT含量差异极显著(P＜0.01)。将0.5%和1%的虎杖提取物添加到饲料当中发现，0.5%的虎杖提取物对于防治肝损伤有很好效果，可以显著降低GOT、GPT、LDH 含量。

血清总蛋白及白蛋白是反映肝功能正常与否的两个重要指标[11－13]，当肝脏损害达到一定程度时，两个指标在血清中的含量便会发生变化，本试验中，在CCl4所造成的肝损伤中，TP与ALB的代谢发生了异常变化，含量均显著降低，而在保肝药物虎杖提取物组，0.5%和1%的虎杖提取物对于抗CCl4损伤有很好的效果，与CCl4组相比，差异显著(P＜0.05);与空白对照组相比，差异不显著(P＞0.05)，以0.5%的虎杖提取物保肝效果最好。

过氧化氢酶(CAT)广泛存在于动物的各个组织中，以肝脏中浓度居高，在调节细胞免于活性氧的氧化损伤过程中发挥着重要的作用[14]。CAT在一定条件下可清除机体产生的自由基，使其浓度逐渐降低，保护机体免受损害。而T-AOC是用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标，反映了由谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等酶促系统和由维生素E、谷胱甘肽、维生素C等组成的非酶促系统的总的抗氧化能力，T-AOC的大小可从总体上反映机体防御系统抗氧化能力的高低[15－16]。本试验中当CCl4造成肝损伤时，T-AOC和CAT含量均显著下降，与空白对照组相比，差异显著 (P＜0.05)。1%虎杖提取物保肝组效果明显，能显著提高T-AOC和CAT含量，与空白对照组相比，差异不显著(P＞0.05)，对于治疗肝损伤有很好的疗效。

综上所述，基础日粮中添加不同浓度的虎杖提取物可以在一定程度上提高建鲤机体的抗氧化功能，降低氧自由基和脂质过氧化物的产生，保护细胞膜结构与功能的完整，缓解CCl4对建鲤肝组织损害。尤其是1%的虎杖提取物效果最明显，为以后鱼类肝胆综合症治疗的药物开发奠定了基础。

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