广西防城港首次截获苜蓿黄萎病菌

黄胜光， 卢兆山， 邱世明， 奚国华， 陆 道， 钟恒禄

（广西防城港出入境检验检疫局，538001）

广西防城港首次截获苜蓿黄萎病菌

黄胜光， 卢兆山， 邱世明， 奚国华， 陆 道， 钟恒禄

（广西防城港出入境检验检疫局，538001）

从一批进境的美国苜蓿草样品中保湿分离得到了3株与苜蓿黄萎病菌（Verticillium albo-atrum）相似的目标菌VA1、VA2、VA3。该目标菌在PDA上生长迅速，菌丝生长0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可见的菌落斑点；菌落为白色圆形，边缘规则呈圆形，菌丝较致密，气生菌丝较少，菌落中心乳白色奶冻状；培养4～5d即后产生气生典型轮枝状分生孢子梗，7～8d后菌落中央表面因产生休眠菌丝开始变成黑褐色至黑色，20d后菌落的表面和背面大部分均变黑色，仍不产生微菌核和厚垣孢子。该目标菌的纯培养用V.albo-atrum特异引物Vaa1／Vaa2进行检测，PCR扩增后得到预期330bp的产物片段，产物序列与V.albo-atrum相应序列的相似性为100%。从而鉴定确认该目标菌为苜蓿黄萎病菌V.albo-atrum。

苜蓿黄萎病菌； 检疫； 口岸截获

致 谢： 目标菌纯培养送至江苏出入境检验检疫局，由吴翠萍、李彬复核确认，特此致谢。

联系方式 Tel：0770-2822708；E-mail：gxhsg＠163.com

轮枝菌的2个最重要植物寄生菌就是苜蓿黄萎病菌（Verticillium albo-atrum）和棉花黄萎病菌（V dahliaeKlebahn）［1］。其中苜蓿黄萎病菌危害大、致病力强是我国检疫性真菌病害。此病最早于1918年发现于瑞典Hedlund，1923年－1950年基本遍布整个北欧［2］，1977年美国第一次报道发现苜蓿黄萎病菌［3］，从此此病在美国快速扩展，成为许多地方苜蓿种植的一个重要限制因素［4－5］。

2010年10月下旬，防城港检验检疫局受理报检了一批从美国进口的苜蓿草，该批货物共5个集装箱，重量118.6t，货值3.38万美元。检验检疫人员对该批货物实施了现场查验、抽样。样品经实验室保湿培养，发现疑似苜蓿黄萎病菌，分离纯化后获得的纯培养，观察和测量其形态特征，同时通过PCR检测以及PCR扩增产物经测序与基因库比对分析，确认该批货物含有我国禁止进境植物检疫性有害生物——苜蓿黄萎病菌（V.albo-atrum）。发现疫情后，该局根据相关规定及时出具了《检验检疫处理通知书》，对该批货物已作监督退运处理。现将检疫鉴定结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

美国进境紫花苜蓿干草样品，试验样品重量为5袋计5kg，阳性对照为V.albo-atrumM1菌株（由江苏出入境检验检疫局吴翠萍女士提供）。

1.2 样品保湿培养

尽可能地挑取枯黄的茎秆以及维管束褐变的茎秆样品，每根茎秆剪取一段，约长4cm，共剪取100根，加入1%次氯酸钠溶液，消毒1min，取出用无菌水漂洗3～4次，分别均匀摆放到15套灭菌9cm培养皿中，置于24℃黑暗条件下保湿培养。

1.3 疑似目标菌的观察

保湿培养7d后在体视镜下逐根观察苜蓿草茎秆段，观察有无典型轮生树枝状分生孢子梗产生。

1.4 目标菌的形态学鉴定

用接种针沾下分生孢子梗顶端的孢子团，在含青霉素的培养基上画线分离培养，进一步进行单孢分离而获得纯培养。观察单孢分离培养后菌落生长的形态、菌丝特征，以及分生孢子梗和分生孢子，有无休眠菌丝、厚垣孢子、微菌核产生等情况。

1.5 目标菌纯培养的PCR检测

取疑似目标菌丝纯化后液氮研磨提取DNA，取1μL为模板。试验采用V.albo-atrum特异性引物Vaa1： 5′-CCGGTACATCAGTCTCTTTA-3′ 和Vaa2：5′-CTCCGATGCGAGCTGTAAT-3′ 进 行PCR检测［6］，预期扩增产物为330bp，引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应体系为：premix 15μL，10μmol／L、下游引物Vaa01／Vaa2各1μL，模板DNA 1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，以灭菌超纯水补足总体积至30μL。阳性对照模板为菌株M1的DNA，阴性对照模板为超纯水。反应程序为：94℃变性5min；进入循环，95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

取20μL扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中进行电泳，GEL RED染色后用凝胶成像系统分析。

2 结果

2.1 目标菌的发现

在体视镜下观察所有100根苜蓿草茎秆段，发现其中3根有典型轮生树枝状的分生孢子梗产生，分生孢子梗直立，梗上每节轮生2～4个小梗，在小梗顶端产生分生孢子团（图1a）。

图1 苜蓿黄萎病菌的形态鉴定

2.2 目标菌形态学的观察与测量

用接种针在苜蓿草段的分生孢子梗顶端的孢子团沾一下，分别在含青霉素的PDA上画线分离，约培养20h分生孢子即开始萌发，用接种铲挑取萌发的单孢进行培养而获得纯培养。对这3根苜蓿草段上分生孢子分离而获得的纯培养分别编号为VA1、VA2、VA3。

目标菌在PDA上生长迅速，菌丝生长0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可见的菌落斑点。菌落边缘规则呈圆形或近圆形，菌丝较致密，气生菌丝较少，菌落中心乳白色奶冻状（图1b）。初期主要产生生长于培养基下的营养菌丝，4～5d后产生典型的气生轮枝状分生孢子梗，可见二次分枝，有隔、无色至淡色，梗上每节轮生2～4个小梗，小梗大小为（21～45）（～64）μm×（1.5～3.5）μm，平均大小为33.14μm×2.18μm。分生孢子椭圆形、圆筒形，无色，单孢，少数孢子1隔，大小为（2.5～12.5）（～16）μm×（2～4.5）μm，平均大小为6.88μm×3.22μm（图1c）。培养7～8d后菌落中央因产生休眠菌丝开始变成黑褐色，休眠菌丝黑暗褐色至黑色（图1d），直径3～9μm，分隔规则，隔膜间膨大，胞壁增厚，呈念珠状，有时集结成菌丝结或瘤状菌丝体，培养20d不产生厚垣孢子和微菌核。据此，该目标菌的形态特征基本与有关标准描述的苜蓿黄萎病菌相吻合［7］。

2.3 PCR检测结果

对分离得到的目标菌株纯培养用V.albo-atrum的特异性引物Vaa1／Vaa2进行PCR扩增，结果表明，3个菌株均呈PCR阳性。

图2 目标菌株纯培养PCR检测电泳图

2.4 PCR扩增产物经测序与基因库比对分析

测序所得333bp长序列，经GenBank（NCBI）Blast分析（表1）表明，序列和X60705、GU291258、GQ495790、GQ336791等17个菌株登记序列100%相同，与Z29510、Z29509、GQ495792等33条序列有3个碱基的差异。

表1 菌株测序所得序列与GenBank（NCBI）已有苜蓿黄萎病菌序列Blast比对表

综上所述，鉴定该批苜蓿草带有我国禁止进境的检疫性病菌——苜蓿黄萎病菌（V.albo-atrumReinke et Berthold）。这是防城港检验检疫局首次截获该菌。

3 讨论

近年来，我国从美国进口苜蓿草呈大幅增长的趋势，2007年不足1万t，2009年为7.6万t，而2010年高达22.72万t。苜蓿黄萎病菌是我国重要的进境检疫性病菌，不仅对苜蓿草造成危害，还会对啤酒花、蛇麻草、花生和马铃薯等多种园艺作物及经济作物造成严重危害［8］；该病菌可通过昆虫、水流、风、收割机械、花粉等近距离传播［9－13］，通过干草、种子、块茎及病残体等进行远距离传播［14］，因此来自苜蓿黄萎病发生区的苜蓿饲草传带苜蓿黄萎病的风险很高。同时我国当前苜蓿生产主栽品种多为感病品种，该病菌在我国的适生性强，特别在我国西北、东北以及华北地区的苜蓿种植区适生程度处于较高水平［15］。一旦苜蓿黄萎病传入定殖蔓延，对苜蓿生产将造成毁灭性打击。因此，各口岸必须加强检疫，严防该病的传入与传播。

本试验培养的苜蓿黄萎病菌形态学上与其相似的轮枝孢属近似种V.dahliae、V.nigrescens、V.nubilum和V.tricorpus相比，在分生孢子梗长度、轮生小梗数目、小梗和分生孢子的大小之间有差别也有交叠［16－20］，但 由 于V.dahliae在 PDA 上 培 养 10～14d后产生黑色微菌核，V.nigrescens产生黑褐色厚垣孢子，V.nubilum亦生黑褐色厚垣孢子，V.tricorpus产生休眠菌丝、微菌核和厚垣孢子［21］，而苜蓿黄萎病菌只产生休眠菌丝不产生微菌核和厚垣孢子；同时本试验还通过设计特异性引物对该菌进行PCR检测，因而较容易将苜蓿黄萎病菌与这几个近似种区别开来。

本试验采用茎秆保湿培养法，可直接在体视镜下观察到疑似目标菌分生孢子梗和分生孢子团，实践中作者尝试过直接用挑针沾取这些分生孢子团进行PCR检测，效果很好。实际工作中可以将目标菌分离纯化和PCR检测同步进行，以便进一步缩短检测时间。

本试验从样品保湿培养7～9d、目标菌分离纯化4～5d、PCR检测2～3d、直到最后结果确认所需时间在13～17d，而目前行业标准《苜蓿黄萎病检疫鉴定方法》SN／T 1145—2002中保湿培养需20d、还有分离纯化、致病性检测等，这样时间会拉得很长，远不能适应当今国际贸易的需求。建议国家质检总局尽快组织专家对该行业标准进行修订。

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First interception ofVerticillium albo-atrumin Fangchenggang of Guangxi

Huang Shengguang， Lu Zhaoshan， Qiu Shiming， Xi Guohua， Lu Dao， Zhong Henglu
（Fangchenggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangxi538001，China）

Three strains of the fungus，namely VA1，VA2 and VA3，were isolated from a batch of alfalfa samples，which were imported from USA and incubated under moist conditions，demonstrating the characters similar toV.albo-atrum.The strains grew rapidly on the PDA，with the colony growing at 0.8-1.0mm／d.After 2-3 days，the spot colony could be seen on the PDA.In addition，the colony had a regular and rounded margin with white compact mycelium and fewer aerial mycelia.The target fungus produced typical round aerial branched conidiophores after 4-5 days，and then became dark brown to black along with production of resting hyphae at the centre of the colony after 7-8 days，and the color of the surface and most of the back of the colony changed to black 20 days later，but still could not produce micro-sclerotia and chlamydospores.The pure cultures of the target germ were detected by the specific primers Vaa1／Vaa2.As expected，a330 bp fragment was obtained by PCR amplification.The similarity between the product and corresponding sequence inV.albo-atrumwas 100%.Therefore，it was confirmed that the target germ wasV.albo-atrum.

Verticillium albo-atrum； inspection； interception at port

S 435.4

B

10.3969／j.issn.0529-1542.2012.01.040

2011-04-29

2011-05-15