金刚天盾液对免疫力低下小鼠免疫功能的影响

张亚茹 郑有丽 丛峰松

上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240

用现代免疫学理论和技术，研究中药对增强与调节机体免疫功能的作用，这对阐明有关中医理论的物质基础有着十分重要的意义。金刚天盾液由红肾豆、川芎、蜂胶等数种天然药物经科学配伍而成。已有的研究发现，金刚天盾液可调整机体各系统脏器的功能，对免疫细胞和免疫分子均有调节作用。本文研究旨在进一步探讨金刚天盾液对免疫力低下小鼠免疫调节作用的分子免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 金刚天盾液由贵州天盾免疫制品公司提供;注射用环磷酰胺由上海华联制药有限公司提供。细胞因子检测试剂盒均购于美国 R＆D公司。流式细胞仪，2000FCA，美国BD公司生产。

1.2 动物 昆明系雄性小鼠30只，6-8周，体重为20±2g，由中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0003)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立与分组 将昆明系雄性小鼠随机分为3组：空白对照组、模型组和药物组，每组10只。空白对照组：实验进程中正常饲养不作任何处理;模型组：腹腔内注射100 mg/kg环磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，连续3天;药物组：腹腔内注射100 mg/kg环磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，连续3天，并在造模第一天在小鼠左胫前肌涂抹给药，0.1 mL/只，一周后加强免疫1次，剂量同第一次。4d后采集样本。

1.3.2 小鼠免疫器官指数的测定 小鼠称量体重后，颈椎脱臼处死小鼠，取胸腺、脾脏称其湿重，计算胸腺指数和脾指数：

胸腺指数=胸腺重×1000/体重

脾指数=脾重×1000/体重

1.3.3 小鼠血清IgG，IgM水平的测定 按试剂盒说明书方法，测定小鼠血清中IgG，IgM含量。

1.3.4 小鼠脾组织T淋巴细胞及其亚群CD4+，CD8+及CD4+/CD8+的测定 无菌取脾，置于盛有适量无Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个胞悬液，经200目筛网过滤，将细胞悬浮于1 mL的完全培养液中，调整细胞浓度1×109L-1，用微量移液器小心地将100μL充分混匀的脾细胞悬液加到进样管的底部，加20μL单克隆抗体，低速振荡混匀3 S，室温避光孵育30 min，于countler-PREP破碎红细胞后，上流式细胞仪检测T细胞亚群含量。

1.3.5 小鼠血清IFN-Y、IL-10水平的测定 按试剂盒说明书方法，测定血清中IFN-Y、IL-10的水平。

2 结果

2.1 对免疫力低下小鼠免疫器官的影响 由表1得出，与正常对照组相比，模型组脾脏和胸腺指数显著降低，差异有统计学意义，P＜0.01。与模型组比较，药物组小鼠脾脏指数明显增加，具有统计学意义，P＜0.01，胸腺指数也有所增加，但差异不显著。

表1 金刚天盾液对免疫力低下小鼠免疫器官重量的的影响 (n=10，mean±s)

2.2 对免疫力低下小鼠血清IgG，IgM水平的影响 由图1得出，与正常对照组相比，模型组小鼠血清IgG，IgM水平明显降低，具有统计学意义，P＜0.01。与模型组比较，药物组小鼠血清Ig G，Ig M水平均明显增加，具有统计学意义，P ＜0.01。

2.3 对免疫力低下小鼠脾组织T淋巴亚群的影响 由表2看出，与正常对照组相比，模型组小鼠脾脏CD4+细胞亚群百分比下降，CD8+细胞亚群百分比上升，具有显著差异，P＜0.05，CD4+/CD8+比值明显降低，具有极显著性差异，P＜0.01。而药物组能明显抵消环磷酰胺破坏免疫力的作用，具有显著性差异，P＜0.05。

2.4 对免疫力低下小鼠血清IFN-γ、IL-10水平的影响由图2所示，与正常对照组相比，模型组小鼠IFN-γ明显降低 ({＜0.01)，IL-10明显升高。与模型组比较，药物组小鼠IFN-γ水平明显增加 (P＜0.01)，IL-10呈降低趋势。

表2 金刚天盾液对免疫力低下小鼠体液T细胞亚群的的影响 (n=10，mean±SD)

3 结论

胸腺、脾脏为机体的重要淋巴器官。胸腺是T细胞发育，分化，成熟的场地，其结构及功能与机体状态紧密相关。胸腺指数的降低以及胸腺萎缩，都是小鼠以细胞免疫为主的免疫抑制的表现［1］。脾脏是体内最大的外周免疫器官，脾脏的免疫细胞以B淋巴细胞为主，而B淋巴细胞是参与体液免疫的主要细胞，因此脾脏与机体体液免疫的关系密切［2］。胸腺指数和脾指数直观的反应了免疫机体功能的强弱［3］。本实验表明，金刚天盾液对环磷酰胺所致免疫力低下小鼠脾脏的发育有促进作用，对胸腺的发育也有一定的促进作用。

T淋巴细胞按其功能可分为CD4+和CD8+两个亚群。CD4+T淋巴细胞在机体的免疫反应中处于非常重要的中心地位，它通过分泌多种淋巴因子激活其他T、B细胞亚群及参与免疫反应的其他细胞，使其增殖和分化，并协调免疫细胞间的相互作用，发挥机体免疫系统的功能［4］。CD4+/CD8+的比值上升，提示免疫应答的正调节占优势，而比值下降，提示免疫功能低下［1］。

本文通过对外周血中T淋巴细胞亚群的测定，表明金刚天盾液能够使环磷酰胺所致免疫力低下小鼠CD4+T淋巴细胞的百分含量升高，使CD4+/CD8+的比值上升，提示金刚天盾液对T淋巴细胞免疫系统起正调节作用。

IgG、IgM水平则反映了体液免疫能力［5］。本研究表明金刚天盾液促进免疫力低下小鼠IgG、IgM分泌增加。说明金刚天盾液不但促进了机体细胞免疫功能的增强，同时对体液免疫也有促进作用。

Th1和Th2细胞分别调控细胞和体液免疫，Th1和Th2极化是免疫应答调节中的关键环节，一旦Th1和Th2细胞之间的平衡被打破，必然会使某一种免疫占据优势，另一种免疫处于劣势，从而发生疾病［6］。正常状态下，体内Th1和Th2可同时产生Th1型和Th2型细胞因子。Th1细胞主要分泌 IL-2、IL-3，IFN-γ，LT，TNF-α和 GMCSF，通过促进 C T L、NK细胞及巨噬细胞活化和增殖，达到抗肿瘤，抗病毒的效果。IFN-γ是Thl的特征性细胞因子。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等Ⅱ类细胞因子，其主要功能在于刺激 B细胞分化为浆细胞，并产生抗体，参与体液免疫。其中IL-10除了具有Th2型细胞因子作用外，又有其他的生物学作用：抑制Th1类细胞因子的合成及其活性，尤其抑制 IFN- γ 的产生［2，7，8］。

本研究发现，相对于正常对照组，环磷酰胺所致免疫力低下小鼠IL-10分泌水平维持相对较高水平，IFN-γ分泌水平相对较低，提示环磷酰胺所致免疫力低下小鼠可能是以体液免疫为主。本次研究发现金刚天盾液号能够降低Th2型细胞因子IL-10的合成，同时明显增加Th1型细胞因子IFN-γ的合成，使Th1和Th2细胞功能极化趋于动态平衡。

本文通过观察金刚天盾液对多项免疫指标的影响，证明金刚天盾液可提高环磷酰胺所致免疫力低下模型小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能，能够纠正T淋巴细胞亚群的紊乱，使免疫力低下小鼠CD4+/CD8+比值提高至接近正常水平，促进B细胞产生抗体，诱导干扰素分泌等，从而达到提高小鼠免疫功能的作用。

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