HPLC 法测定复方喜树碱贴膏中喜树碱的含量

刘伟林

广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021

喜树碱 (Camptothecine)为具抗肿瘤活性，为植物喜树的果实中提取的生物碱，其注射液作为抗恶性肿瘤药已在临床上应用。复方喜树碱贴膏为喜树碱、山苍子油、冰片等的复方橡胶制剂，为角质促成剂，减少局部皮肤角质增生，主要用于斑块状，寻常型银屑病。其主要有效成分为喜树碱，具有抗肿瘤活性，故对其进行含量测定是产品质量控制的关键。该制剂原含量测定方法为紫外导数光谱法，是测定共轭体系的吸收光谱，而复方喜树碱贴膏除含喜树碱外，还共存有10-羟基喜树碱 (10-hgdroxg Camptothecine)、10-甲氧基喜树碱 (10-methoxy Camptothecine)等同系物，因此其测定受到干扰。现采用HPLC法，将喜树碱与其他干扰成分分离，结果满意。

我们采用高效液相色谱法，对喜树碱进行含量测定方法研究，经方法学考察，其准确性、精密度、重现性均较好，可用于产品的质量控制。

1 仪器与试药

仪器 ①Waters高效液相色谱仪 (1、600E泵，2487紫外检测器，717自动进样器;2、515泵×2，996二极管阵列检测器，717自动进样器)，Millennium32色谱工作站，Inertsil ODS-3 C18色谱柱，4.6×250mm，5μm; ② Sartorius BP211D电子天平。

喜树碱对照品 (20011025)由广西东兰药厂提供 (高效液相法归一化纯度检查为98.80%。)

样品 复方喜树碱贴膏，批号：20080301，20080302，200820303;阴性样品 (内含除喜树碱外的其它成分);均由桂林天和药业股份有限公司提供。

流动相用的甲醇、四氢呋喃均为色谱纯，水为纯化水。其余试剂均为化学纯。

2 试验及结果

2.1 溶出及提取条件的选定

本品剂型为橡胶膏剂，方中除所含4种原料相互干扰外，基质 (主要由橡胶、松香、溶媒等组成)对含量测定的影响较大，应尽量予以清除。故采取先以石油醚将膏体从载体中溶解分离，再用75%甲醇提取喜树碱。

经实验，用75%甲醇提取5次后，提取液在紫外光灯(254nm)下检视，已无荧光，说明喜树碱已被提取完全。为保证提取完全，将提取次数定为6次。

2.2 对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取喜树碱对照品16.14mg(相当于喜树碱纯品15.95mg)，置200ml量瓶中，加甲醇适量，于60℃水浴中振摇溶解，冷却后用甲醇稀释至刻度，摇匀;即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，除去隔膜，剪成细条，混匀，精密称取适量W(约相当于1/2片)，置锥形瓶中，用石油醚 (60～90℃)20、15、10、10ml搅拌洗涤4次，洗涤液合并，移入分液漏斗中，再用75%甲醇溶液振摇提取 6次 (20、15、15、15、15、15ml，每次用75%甲醇溶液先洗涤锥形瓶中布条)，分取下层液，滤入100ml量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取不含喜树碱的阴性样品10片，按“供试品溶液的制备”项下的方法操作，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

2.3.1 色谱条件 柱温30℃，检测波长：254nm，流动相：甲醇—10%四氢呋喃 (48：52)，流速：1.0ml/min，进样量为 20μl。

2.3.2 检测波长的确定

采用上述的液相色谱条件，取喜树碱对照品溶液注入液相色谱仪中，进行二极管阵列检测器光谱扫描，其在253.6nm、358.2nm 和 366.5nm 处都有吸收峰，以 253.6nm吸收最高，故选取254nm作为测定波长。

在上述色谱条件下，分别吸取对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液各20μ1，注入液相色谱仪，色谱图见图1、2、3。供试品在与喜树碱对照品相同的保留时间里有一对应的色谱峰，阴性对照溶液 (缺喜树碱)无干扰;以喜树碱计，理论板数为3000，分离度大于1.5，故此色谱条件可满足测定的要求。

2.4 线性关系考察

精密吸取喜树碱对照品溶液 5.0、10.0、20.0、30.0、40.0ml，分置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别取上述对照品溶液20μl注入液相色谱仪，测定。以进样量X(μg)对峰面积Y(A)进行线性回归分析得回归方程：y=2584829.1x-6368.3，r=1.0000。

结果表明，喜树碱进样量在0.039875～0.319μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

吸取供试品溶液 (批号20080301)各20μl，分别连续注入液相色谱仪6次，测定峰面积，RSD为0.25%(n=6)，结果表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取样品 (批号20080301)，依法操作，平行操作6份，吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，计算含量，含量分别为 83.60%、83.94%、84.04%、83.25%、83.77%、83.45%，RSD为0.36%，结果表明重复性较好。

2.7 稳定性试验

取对照品溶液，按照拟定的含量测定方法测定，放置1、2、4、6、12小时后，再次测定，RSD为0.68%，结果表明溶液稳定性良好。

2.8 回收率试验

采用模拟回收试验方法。取阴性样品 (缺喜树碱)1/2片，除去隔膜，剪成细条，置锥形瓶中，共9份，分别精密加入喜树碱对照液 ［精密称取喜树碱对照品①66.98mg(相当于 66.18mg)，②82.96mg(相当于 81.96mg)，③99.04mg(相当于97.85mg)，分置 100ml量瓶中，加甲醇适量，于60℃水浴中振摇溶解，冷却后用75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。］1ml，每个浓度加3份，用石油醚(60～90℃)20、15、10、10ml搅拌洗涤四次，洗涤液移入分液漏斗中，按“2.2.2供试品溶液的制备方法”制备供试品溶液，依法测定，计算回收率。结果三种浓度共9份的平均回收率为97.8%(RSD为0.62%，n=9)。

2.9 含量测定及限度

取本品3批，按拟定的含量测定方法测定，结果分别为 83.64%(RSD 为 0.55%，n=2)、90.30%(RSD 为0.15%，n=2)、84.24%(RSD 为 0.60%，n=2)。由结果知，含量均在标示量的83.0% ～91.0%以内，考虑到本品为外用橡皮膏剂，生产工艺烦琐，样品含量差异较大，故拟定含量限度为80.0% ～120.0%。

3 讨论

本文建立了反相高效液相色谱法测定复方喜树碱贴膏中喜树碱含量得方法，为进一步完善复方喜树碱贴膏的质量标准提供了准确、简单、可行的测定方法。

我们比较了甲醇-水、乙腈-水及乙腈-10%四氢呋喃等流动相系统，结果发现后者具有最佳分离效果。

在实验中我们发现，当提取温度较高时，容易将喜树碱提取完全。当温度高于30℃时，提取次数仅为3～4次即可将喜树碱提取完全，因此为了将喜树碱提取完全，应控制提取温度在一个较高的范围。