RP-HPLC 法同时测定枇杷茎枝、叶中齐墩果酸和熊果酸的含量

陈白灵 苏本伟

1.广西玉林市骨科医院，广西 玉林 537000;2.广西钦州市中医院，广西 钦州 535000

枇杷系蔷薇科枇杷属植物枇杷 (Eriobotrya Japonica(Thunb.)Lindl.)，广泛分布于广东、广西、江苏、福建、江西等地，具有较高的药用价值［1］。近期对枇杷的研究主要集中于枇杷叶，研究表明其主要成分为三萜酸和倍半萜及其苷类，药理活性的报道主要集中在三萜酸的抗炎、降血糖和抗病毒活性方面，齐墩果酸、熊果酸含量明显占优势［2］。近年越来越多的文献报道采用高效液相色谱法测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量［3，4］，但对枇杷茎枝中熊果酸和齐墩果酸的含量测定尚未见报道。本实验采用反相高效液相色谱法同时测定枇杷树茎枝、叶中熊果酸和齐墩果酸的含量，具有准确、灵敏、快捷的特点，为对其进一步开发利用提供理论依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪;色谱柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);GH-252型电子分析天平 (AND)，BP121S型电子分析天平 (德国Sartorius公司);LG16-W高速微量离心机 (北京医用离心机厂);KQ-300DB型数控超声波清洗器 (昆山)。齐墩果酸对照品 (中国药品生物品检定所，批号：110709-200505);熊果酸对照品 (中国药品生物品检定所，批号：110742-200516);乙腈、甲醇 (CNW、色谱纯)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。样品分别采自广西巴马、都安、钦州、玉林，采集时间为2011年5～7月，将采集的样品洗净阴干，枝、叶分开粉碎过45目备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 岛津LC-20AT高效液相色谱仪;色谱柱Agilent-C18(5μm，4.6×250mm);流动相：甲醇-乙腈-0.05%醋酸铵溶液 (12：67：21);检测波长为205nm;流速1.0ml/min，柱温：室温。齐墩果酸、熊果酸可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，对照品及样品色谱图见图1。

2.2 对照品储备液的制备 精密称取齐墩果酸、熊果酸适量，加乙醇溶解并稀释成每1ml中含0.209mg齐墩果酸、0.628mg熊果酸的混合对照品储备液。

2.3 样品溶液制备 精密称取样品粉末0.50g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇溶液25mL，超声提取30分钟，冷却补重，摇匀，离心，经0.45μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。

2.4 线性关系考察 将齐墩果酸、熊果酸混合对照品溶液母液分别稀释成质量浓度为 2.61，13.06，26.13，52.25，104.50，209mg · L-1;7.85，39.25，78.50，157，314，628 mg·L-1对照品溶液，分别进样10μl，记录，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，将所得数据进行线性回归。结果齐墩果酸回归方程为 Y=4427.6X+4738.7，r=0.9998，线性范围为 2.61 ～209mg·L-1，熊果酸回归方程为 Y=4987.6X+13576，r=0.9999，线性范围为7.85～628mg·L-1，结果表明在上述浓度范围内，2成分浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，1，2，4，6，8，12h进样10μl，测定峰面积，计算RSD，结果齐墩果酸RSD=0.99%，熊果酸RSD=0.76%，表明样品在12h内保持稳定。

2.6 精密度试验 取混合对照品重复进样5次，每次进样10μl，测定峰面积，计算 RSD，齐墩果酸 RSD=0.60%，熊果酸RSD=0.90%，结果表明仪器精密度符合要求。

2.7 重复性试验 取同一批柿叶样品，共5份，按“2.2”项制备样品溶液，分别进样10μL，测定峰面积，计算含量的RSD，齐墩果酸 RSD=0.80%，熊果酸 RSD=0.90%，，结果表明重复性良好。

2.8 回收率试验 称取已知含量的琵琶样品6份，称样量约为制备量的一半，分别精密加入齐墩果酸、熊果酸适量，按“2.2”项下方法制备样品溶液，吸取10μl进行测定，计算。结果见表1。

表1 齐墩果酸、熊果酸加样回收试验结果

表2 不同产地枇杷茎枝、叶齐墩果酸、熊果酸含量

2.9 含量测定 分别取样品溶液10μl进样，测定峰面积，计算齐墩果酸、熊果酸的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法的选择，对提取溶剂和提取方法进行了考察，选用甲醇、乙醇、乙醚作为提取溶剂，进行了索氏提取、回流提取、超声提取，结果显示，甲醇和乙醇超声提取30min即可，但考虑到成本及试剂的毒性，最终选择乙醇作为提取溶剂，方法操作简便、快捷。

3.2 本实验对来自不同产地枇杷树的茎枝及叶中齐墩果酸、熊果酸含量进行测定。结果表明，不同产地的枇杷树中齐墩果酸、熊果酸的含量差异较大，其中以采自广西钦州市的齐墩果酸、熊果酸含量最高，同一产地枇杷树中同一部位齐墩果酸、熊果酸含量不同，熊果酸含量比齐墩果酸高，同一产地枇杷树中不同部位齐墩果酸、熊果酸含量不同，茎枝比叶含量高。本实验所建立的含量测定方法可同时测定枇杷树茎枝和叶中熊果酸和齐墩果酸的含量，具有准确、灵敏、快捷的特点，为对其进一步开发利用提供理论依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典第一部［S］.2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：1067-1068.

［2］郭宇，吴松吉，朴惠善.枇杷叶的化学成分及药理活性研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17(6)：928-930.

［3］杜丰玉，陈钧，宣寒，等.RP-HPLC测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸［J］.中成药，2006，28(12)：1790-1793.

［4］罗晓清，郭小仪，俞学炜.RP-HPLC法测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸［J］.中国野生植物资源，2004，23(5)：50-51.