轻度脑震荡大鼠神经元细胞凋亡的研究

章升国，熊进挺，曾斌华，王新刚，余振兴，邓培刚

（南昌大学第四附属医院神经外科，南昌 330003）

在现代化社会，随着交通工具的发展，重、中、轻型颅脑损伤日益多见。但是轻型颅脑损伤研究还是处于初步阶段，对脑震荡（CC）发病机制、神经细胞的死亡及凋亡认识尚不完全清楚。细胞凋亡（apoptosis）概念的提出在生命科学领域研究中已引起人们极大的兴趣，有关细胞凋亡在颅脑损伤机制中的研究也日益增多。本研究利用铁锤单摆致伤仪打击大鼠制作轻度脑震荡模型，采用TUNEL（TdT mediated dUTP niekend labeling）法检测大鼠神经元细胞的凋亡情况。

1 材料和方法

1.1 动物、主要仪器和试剂

SD 大鼠 100 只，体质量（280±20）g，月龄 2～3 个月，昆明医学院实验动物所提供。铁锤单摆致伤仪（昆明医学院）；显微镜（日本日立公司）；超薄切片机（瑞士LKB公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（美国 Roche公司提供）。

1.2 分组与动物模型制作

分组：将100只SD大鼠按随机数字表法分为实验组与对照组，每组50只。制模：用铁锤单摆致伤仪对实验组SD大鼠额顶部行1次钝性打击，复制具有一过性脑功能障碍的脑震荡大鼠，大鼠脑震荡的判断标准按文献[1]标准。

1.3 TUNEL法检测

采用TUNEL法检测2组SD大鼠神经元细胞的凋亡情况。在实验组制模后（伤后）6 h，1、2、4、8 d共5个时间点随机处死2组SD大鼠各10只。动物经过灌注、取材、冰冻、切片后参照TUNEL细胞凋亡检测试测盒说明漂洗、孵化、DAB染色。海马区结构各随机选取视野，显微镜下观察每个视野内凋亡细胞数，计算其平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

实验组各时间点凋亡细胞计数均显著高于对照组（P<0.01），对照组各时间点凋亡细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；实验组伤后神经元细胞凋亡数量逐步上升，至伤后2 d达高峰，然后逐步下降，凋亡细胞计数伤后2 d与伤后6 h、8 d比较差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 2组细胞凋亡计数比较 ±s，个

表1 2组细胞凋亡计数比较 ±s，个

*P<0.01与对照组同时段比较；﹟P<0.01与实验组6 h、8 d比较。

组别 n 6 h 1 d 2 d实验组 10 7.68±1.81* 15.14±1.79* 20.26±2.97*﹟对照组 10 1.36±0.28 1.38±0.42 1.46±0.51 4 d 13.42±1.75*1.42±0.62 8 d 8.82±0.88*1.35±0.98

实验组大鼠海马区伤后经DAB染色，见棕黄色大小不一、结构不清的细胞凋亡。伤后6 h、1 d可见细胞核固缩，细胞萎缩，细胞内出现髓样结构，示细胞凋亡。伤后2、4、8 d细胞器消失，细胞核、细胞质萎缩，呈现凋亡小体，这时细胞凋亡发生改变，染色质浓缩成块状，有胞质浓缩，胞体皱缩，细胞体积减小，形状不一的细胞凋亡小体，提示脑震荡后海马区有细胞凋亡（图1）。

图1 实验组大鼠海马区DAB染色（伤后2 d）

3 讨论

细胞凋亡的概念最早由 J.F.Ker等[2]提出，A.Rink等[3]证实在创伤性脑损伤后存在神经元细胞的凋亡，此后有关细胞凋亡在颅脑损伤中的作用与意义日益受到重视，为颅脑损伤后凋亡的启动与调控及抗凋亡治疗研究提供了理论依据。A.Rink等[4]证明创伤性脑损伤（TBI）后出现的凋亡现象是脑细胞死亡的一种重要方式，TBI后6 h，细胞凋亡即可出现，24～72 h达高峰；轻度TBI后，脑皮层凋亡高峰期在伤后1 d，齿状核为1～2 d，白质和海马区则为2～3 d；中度损伤后，凋亡的高峰期皮层为3 d，且有明显的持续上升趋势，海马、齿状核在伤后12 h～3 d持续保持在一定水平，白质为2～3 d。大鼠脑创伤后诱发学习记忆障碍，在齿状回颗粒细胞发现凋亡细胞，表明凋亡是脑创伤记忆障碍的原因之一[5]。弥漫性脑损伤后24 h，海马的CAZ-4区和齿状回可见凋亡细胞数量增加，7 d时达到高峰，同时伴明显的空间学习记忆功能的损伤[6]。大鼠视神经轴索损伤后，视网膜出现视神经元凋亡，1～3 d陆续出现凋亡细胞，5 d达到高峰[7]。TBI患者的大脑中TUNEL检查可显示凋亡细胞，此进一步证实凋亡在脑创伤后脑损伤的作用意义[8]。凋亡是一种在基因调节下进行的细胞主动死亡方式。凋亡现象广泛存在于中枢神经系统（CNS），不仅参与CNS的正常发育过程，在退行性疾病(如阿尔兹海默氏病、帕金森氏病)和脑缺血性损伤中，凋亡扮演重要的角色。近年研究表明，创伤性脑损伤后凋亡参与了脑细胞死亡的机制[9]。

本研究采用铁锤单摆致伤仪打击大鼠额部，大鼠脑震荡后出现继发性脑水肿，轻度缺血缺氧等病理反应，继发性损伤因素随之产生，可激活细胞促凋亡基因和（或）抑制凋亡抑制基因的活性，诱发细胞凋亡发生。本研究采用TUNEL检测细胞凋亡试剂盒来检测大鼠脑震荡后细胞凋亡的发生变化，结果显示,对照组几乎无凋亡细胞存在,实验组存在不同程度的细胞凋亡，于伤后6 h即可出现细胞的凋亡，1 d和2 d达高峰，4 d和8 d略有下降，与以往中、重型颅脑损伤（3～4 d达高峰期，持续 7～8 d甚至10 d高峰期，而后逐步减退）比较，轻度脑震荡后细胞凋亡细胞数量相比中、重型颅脑损伤较少。

[1] 于建云,李俊祥,郭泽云,等.实验大鼠轻中型闭合性脑损伤昏迷指标与分级标准[J].法医学杂志，2008，24（1）：8-11.

[2] Ker J F，Wyllie A H，John A G,et al.failure of Pselectin blockade alone to protect the liver from ischemiareperfusion injury in the isolated blood-perfused rat liver[J].Grastroenterol，2008，14（44）：6808.

[3] Rink A,Fung K M，Trujanouahi J Q，et al.D1 dopamine receptor immunoreactivity in human and monkey cerebral cortex：predominantand extrasynaptic localization in dendritic spines[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，91（12）：5720-5724.

[4] Rink A，Alexander K.Regulation of depotentiation and long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats by dopamine D2-like receptors[J].Cerebral Cortex，2009，13（2）：123-135.

[5] De Keyser J，De Backer J P，Vauquelin G，et al.The effect of aging on the D1 dopamine receptors in human frontal cortex[J].Brain Res，2006，528（2）：308-310.

[6] Hong J，Cui J，zhou Y，et al.Study on coguition disouder and morphologic change of neutous in hippocampus area following tranmatic brain injury in rat[J].Chin Tranmatol，2002，5（1）：36-39.

[7] 孙晓川，卢海涛，郑履平，等.弥漫性轴索损伤对神经元影响的实验研究[J].创伤外科杂志，2003，5（6）：426-428.

[8] Smith J W,Fetsko L A，Xu R，et al.Dopamine D2L receptor knockout mice display deficits in positive and negative reinforcing properties of morphine and in avoidance learning[J].Neuroscience，2009，113（4）：755-765.

[9] 杨云华，廖维宏.脑创伤后细胞凋亡及其基因调控[J].创伤外科杂志，2004，6（6）：462-464.