四妙勇安汤对实验性动脉粥样硬化易损斑块内血管新生的影响*

许颖智，张军平，李 明，李良军，彭 立，张光银，杨 萃，周亚男

(1．天津中医药大学第一附属医院，天津 300193;2．天津中医药大学，天津 300193)

四妙勇安汤对实验性动脉粥样硬化易损斑块内血管新生的影响*

许颖智1，张军平2△，李 明2，李良军2，彭 立1，张光银1，杨 萃1，周亚男1

(1．天津中医药大学第一附属医院，天津 300193;2．天津中医药大学，天津 300193)

目的:探讨四妙勇安汤对动脉粥样硬化(AS)斑块内血管新生的影响及作用机理。方法:随机将40只日本大耳白兔分为对照组10只，实验组30只。对照组给予普通饲料，实验组利用复合因素制备AS易损斑块模型，8周时实验组随机分为模型组、辛伐他汀组、四妙勇安汤组，第24周取材。主动脉切片进行病理形态学观察，测量内膜厚度(IT)、纤维帽厚度(FCT)、纤维帽厚度与内中膜厚度比(FCT/IMT)、脂核与斑块面积比(LCA/PA);免疫组化方法检测CD31、血管内皮生长因子(VEGF)、P38 MAPK水平;RT-PCR方法检测VEGF mRNA表达。结果:与模型组比较，四妙勇安组 IT降低，FCT、FCT/IMT增加;CD31、VEGF、P38MAPK水平及VEGF mRNA表达显著下降。结论:四妙勇安汤可稳定AS斑块，抑制斑块内血管新生，其机制可能与抑制斑块内VEGF和P38MAPK表达有关。

四妙勇安;AS易损斑块;血管新生

AS易损斑块是急性冠脉事件及脑卒中等心脑血管事件的主要原因。在组织学角度，易损斑块被定义为偏心性管腔分布、脂质含量多(脂质池 ＞40%)、炎细胞浸润明显、纤维成分少，纤维帽薄(＜65μm)及新生血管多的斑块［1］。斑块内血管新生成为AS斑块不稳定的重要危险因素，在易损斑块及斑块的易损部位更为明显，与临床心脑血管事件的发生有很大关系。血管新生(angiogenesis)是指在原有的毛细血管基础上通过血管内皮细胞的增殖与迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生的形式生成新的毛细血管的过程。斑块内血管新生是在AS病变基础上发生的，而新生血管又加重了AS病变，在AS斑块的发生发展中斑块内血管新生可能是一个核心事件起着关键性作用。本实验依据AS发病的中医学病机认识，就这一核心问题展开研究。随着对AS发病机制的不断深入认识，人们逐渐认识到热毒血瘀是AS发生发展的的主要病理因素。以往研究表明，具有滋阴活血解毒之功效的四妙勇安汤可抑制 AS的炎症反应和氧化应激［2、3］。本实验从另一角度观察四妙勇安汤稳定AS斑块的作用机理，探讨其对斑块内血管新生的影响机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药物 辛伐他汀:40 mg/片，5片/盒(批号07283)，杭州默沙东制药有限公司;四妙勇安汤煎剂:金银花 30g，玄参 30g，当归 20g，甘草 10g，汤液经过旋蒸仪旋蒸浓缩至每毫升含生药2．25g。四妙勇安汤水煎液制备工艺:前4味药加水温浸30min后，分别加10倍、8倍量水煎煮2次，滤过、合并滤液，14000r/min离心 15min取上清液，采用分子截留值5万的超滤膜进行超滤，超滤过程中控制压力为 0．1mPa，温度30℃ ±1℃。四妙勇安汤水煎液质控标准:金银花(绿原酸不得少于1．5%)、玄参(哈巴俄甘不得少于0.05%)、当归(阿魏酸不得少于 0.05%)、甘草(甘草酸不得少于 2．0%)。

1．2 试剂

VEGF 一 抗 (C-1，SC-7296，SATA CRUZ BIOTECHNOLOGY)、CD31 一抗(JC/70A、ab958、Abcam)。

1．3 仪器

酶标仪(Thermo MK3，上海热电)、电泳仪(DYY-8C，北京六一仪器厂)、PCR 仪(TC-96，杭州博日科技有限公司)、紫外透射仪(UV-254，北京鼎国生物技术发展中心)、OLYMPUS-BX40生物显微镜(奥林巴斯，日本)、HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统(武汉同济医科大学千屏影像工程公司)。

1．4 方法

1．4．1 动物分组及给药 选用普通级雄性日本大耳白兔 40只，体重 2．2kg±0．2kg，由北京市维通利华实验动物中心提供。随机分对照组10只，实验组30只。所有动物均单笼饲养，饮水不限，自由摄食，每日每只给予150g饲料，喂养24周;其正常对照组动物给予普通饲料，其他组动物给予高脂饲料。采用高脂饮食加免疫损伤和球囊拉伤方法建立兔AS斑块模型［4］，自8周时实验组随机分为模型组、辛伐他汀组、四妙勇安组(简称为模型组、辛伐组、四妙组)。各给药组开始给药至24周取材，给药量按动物与人用药量体表面积折算系数15换算。辛伐他汀5mg/kg/次，1次/d;四妙勇安汤按生药量11．25g/kg/次，2 次 /d;模型组给予蒸馏水 10ml/次，2次/d。

1．4．2 标本的收集 24周取材，用3%戊巴比妥钠(30mg·ml－1kg－1)麻醉后将动物固定于手术台，取出主动脉血管组织沿纵轴剪开，用生理盐水轻轻冲洗后一部分置于组织冻存管，液氮保存做PCR备用;一部分置于10%中性福尔马林固定。

1．4．3 标本的测定 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA(%)检测:石蜡包埋，HE、Masson、油红“O”染色，光镜观察病理改变，进行图像分析并测量 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA。测量方法:每张片子选取3个低倍视野(10×10)，每个视野测3次取其平均值。

动脉壁斑块内 CD31、VEGF、P38MAPK检测:采用免疫组化方法，检测分析测量各阳性染色面积占整个场面积的百分比。每张切片随机观察5个不同的高倍镜视野(10×40)，计算阳性细胞(细胞内有黄褐色或棕黄色沉淀物)的面积与整个场面积的百分比并取其平均值。

动脉壁VEGF mRNA的表达测试:采用RT-PCR方法检测，取肉眼有突起地方疑似斑块部位进行组织匀浆，提取总 RNA，逆转录合成 cDNA，以 β-actin为内参做半定量分析。从GenBank中获得已知的兔VEGF mRNA的序列(序列号AY196796)和兔内标基因序列(序列号AF598932)委托上海生工公司合成。反应条件:93℃预变性3 min，93℃ 40 s，72℃ 40s，63℃ 40s，27Cycle，最后 72℃ 延伸 8min。PCR反应产物6μl在1．5%琼脂糖凝胶上电泳 25 min，拍照留取图像，以扩增目的片段与β-actin的灰度比值表示所扩增的目的基因片段的相对表达水平。

2 结果

2．1 四妙勇安汤对腹主动脉病理形态学影响

对照组主动脉内皮细胞完整，中层平滑肌细胞排列整齐，呈长椭圆形。模型组主动脉见有典型斑块形成，表面有纤维组织覆盖，形成典型的较薄“纤维帽”;内膜明显增厚，内皮部分脱落、不完整，内皮下见脂质、泡沫细胞及炎性细胞浸润，弹力纤维断裂溶解，有大量胶原纤维生成。辛伐组内膜增厚，有少量泡沫细胞形成，内皮完整，中膜平滑肌增殖，弹力板尚完整。四妙组内膜增厚，可见若干泡沫细胞，内皮完整，中膜平滑肌增殖，排列尚规则，弹力板尚完整。

2．2 四妙勇安汤腹主动脉内中膜的影响

表1显示，病理检测结果显示，辛伐组和四妙组IT、LCA/PA低于模型组，FCT、FCT/IMT均高于模型组(P ＜0.05，P ＜0．01)。

2．3 四妙勇安汤对腹主动脉组织 CD31、VEGF、P38MAPK水平的影响

表2显示，模型组 CD31、VEGF、P38MAPK阳性面积百分比高于对照组;各给药组 CD31、VEGF、P38MAPK阳性面积百分比均低于模型组(P＜0.05 或P＜0.01)。

表1 各组血管壁IT、IT/MT、FCT、FCT/IMT比较

表2 各组主动脉CD31、VEGF阳性面积百分比(%)比较

2．4 四妙勇安汤对腹主动脉VEGF mRNA表达的影响

模型组 VEGF mRNA 表达(1．39±0．38)高于对照组(0．99 ±0．27)，辛伐组和四妙组 VEGF mRNA表达分别为 1．07 ±0．36、0．64 ±0．31 均低于模型组(P ＜0.05，P ＜0．01)。

3 讨论

1984年Barger等［5］已经发现，内膜血管生成与AS斑块之间存在一定关系，在AS易损斑块形成和发展中起到重要作用。AS斑块内新生血管由简单的内皮细胞围成，周围没有支撑的结缔组织，管壁发育不完善，这些血管脆性大，在周围细胞因子的作用下容易破裂出血，引起急性冠脉综合征。

本实验结果表明，模型组腹主动脉内膜增厚、纤维帽薄、脂核面积增大，斑块内 CD68表达增高，大量巨噬细胞浸润，平滑肌减少;内皮细胞标志物CD31阳性面积百分比明显增高，AS斑块内新生血管增加，模型组主动脉形成易损斑块［1］。

中医学认为，易损斑块是热毒血瘀相互交织、相互影响所致的脉络瘀结。热毒、痰浊、瘀血三者相互胶结沉积于虚损之络脉，加重了脉管的损伤;日久胶结不解，凝之愈坚，瘀结加重，形成 AS易损斑块。本实验针对以上病机，运用具有解毒活血功效的四妙勇安汤对AS易损斑块进行干预。四妙勇安汤出自《验方新编》，由金银花、当归、玄参、甘草4味药组成。方中金银花清热解毒，玄参滋阴清热，当归活血和营，生甘草解毒、调和诸药，全方具有清养结合、毒瘀并驱，共奏滋阴解毒、活血通络之功效。本实验结果表明，四妙勇安汤可降低内膜厚度、增加纤维帽厚度，使巨噬细胞、脂质含量减少，胶原及平滑肌增多，还可降低斑块内CD31的表达，抑制斑块内血管新生，从而稳定AS易损斑块。为阐明其作用机制，本实验对P38MAPK、VEGF及 VEGF mRNA表达进行了观察。

结果提示，模型组斑块内 P38 MAPK和 VEGF活性增高。P38 MAPK是一种重要的蛋白酶，是成纤维细胞分泌VEGF所必需的［5］。MAPK作为转录因子可转运至细胞核内，启动特定基因的表达，完成VEGF相应的促增殖作用［6］。VEGF是一种具有促进新生血管形成和组织修复作用的血管生成因子［7］，能促进内皮细胞分裂、增殖、迁移、趋化，发挥抗细胞凋亡的作用［8］;动员骨髓中的内皮祖细胞进入外周循环，定位到缺血组织，在原位分化形成成熟的内皮细胞，形成新的血管［9］。本研究结果提示，四妙勇安汤具有抑制AS斑块内P38 MAPK活性的作用，并具有和辛伐他汀同样的效果［10］，抑制斑块内VEGF蛋白和基因表达。这可能是四妙勇安汤抑制斑块内血管新生的机制之一。

［1］吕晓蕾，龚开正，张振刚．对动脉粥样硬化斑块易损机制的新认识［J］．临床荟萃，2006，21(9):681-683．

［2］张军平，李 明，李良军，等．四妙勇安汤对实验性动脉粥样硬化模型兔血清 ox-LDL、NO及 MPO的影响［J］．中医药通报，2009，8(2):53-58．

［3］张军平，许颖智，李 明，等．四妙勇安汤对实验性动脉粥样硬化模型氧化应激及炎症反应的干预研究［J］．中医杂志，2010，51(1):72-74．

［4］张军平，许颖智，李良军，等．实验性动脉粥样硬化模型复合建模的方法及评价［J］．中国比较医学杂志，2009，19(1):41-45．

［5］Thobe BM，Frink M，et al．Src family kinases regulate p38 MAPK-mediated IL-6 production in Kupffercellsfollowing hypoxia［J］．American Journal of Physiology，2006，291(4):76-82．

［6］Duyndam MC，Hulscher ST，et al．Evidence for a role of p38 kinase in hypoxia-inducible factor 1-independent induction of vascular endothelial growth factor expression by sodium arsenite［J］．Biol Chem，2003，278(68):85-95．

［7］JinX，GeX，et al Expression and function of vascular endothelial growth factor receptors(Flt-1 and Flk-1)in vascular adventitial fibroblasts［J］．Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2007，43(3):292-300．

［8］Wang Y， Haider HK， et al． Ashraf M． Combining pharmacological mobilization with intramyocardial delivery of bone marrow cells over-expressing VEGF is more effective for cardiac repair［J］．Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2006，40(7):36-45．

［9］Rehman J，Traktuev D，Li J，Merfeld-Clauss S，Temm-Grove CJ， Bovenkerk JE， et al． Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells． J．Circulation，2004，109(12):92-98．

［10］张 路，吴宗贵．辛伐他汀对家兔主动脉粥样硬化斑块血管内皮生长因子表达的影响［J］．第一军医大学学报，2004，25(5):560-562．

Effects of Simiao Yongan Tang on angiogenesis in plaque of experimental artherosclerosis

XU Ying-zhi1，ZHANG Jun-ping2△，LI Ming2，LI Liang-jun2，PENG Li1，ZHANG Guang-yin1，YANG Cui1，ZHOU Ya-nan1
(1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China;2．The First Hospital affiliated to Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China)

Objective:To observe the effect of Simiaoyongan Decoction(SYD)on angiogenesis in rabbit’s Atherosclerosis(AS)plaque．Methods:40 Japanese white rabbits were randomly divided in two groups，that is，the control group(n=10，normal diet)and the experiment group(n=30)，in which AS vulnerable plaque model was established by feeding high-fat diet，injecting Bovine Serum Albumin(BSA)and balloon catheter overstretching on abdominal aorta artery．At the 8th week，30 animals in experiment group were randomly divided in three groups，that is，model group(n=10)，SYD group(n=10)，simvastatin group(n=10)．The rabbits were sacrificed at the 24th week．Pathological changes were observed by HE，oil red O and Masson staining，and then measured intimae thickness(IT)，fiber cat thickness(FCT)，FCT/IMT，lipid core area to plaque area ratio(LCA/PA)．CD31，VEGF，P38 MAPK protein were detected with immunohistochemistry(IHC)，and VEGF mRNA signal was assessed by polymerase chain reaction(PCR)．Results:IT in SYD group was lower and FCT，FCT/IMT levels were higher than that of the model group．Compared with the model group，the levels of CD31，VEGF，P38MAPK in the SYD group decreased，and VEGF mRNA expression was inhibited by SYD(P＜0．01or P ＜0.05)．Conclusion:SYD could suppress angiogenesis in AS plaque to stabilize AS vulnerable plaque．It may act by decreasing P38 MAPK，VEGF protein and VEGF mRNA expressions．

Si miao yong’an Decoction;angiogenesis;atherosclerosis plaque

R285．5

B

1006-3250(2012)02-0161-03

教育部科学技术研究重点项目资助(206009);国家自然科学基金项目 (30901890);天津市自然科学基金重点资助项目(09JCZDJC20700)

许颖智(1979-)，女，山东人，医学博士，从事中医心脑血管疾病临床与研究。

△通讯作者:张军平(1965-)，男，教授，主任医师，博士研究生导师，从事中西医结合心脑血管疾病的临床与研究，E-mail:tjzhtcm@163．com。

2011-08-09