脂易消对非酒精性脂肪肝CYP2E1基因表达的调控

陈玉翠 周岳君 赵国强 田有坤

目前认为，脂肪肝的发生与脂肪细胞因子相关性损害有关。脂肪组织是一个新的内分泌器官，对全身各器官系统及脂肪组织本身有重要调节功能。它们通过诱导脂肪细胞的凋亡及脂肪细胞的分化，调控脂肪组织的量［1］。目前，对非酒精性脂肪肝(NAFL)发病机理的研究已深入到基因水平，有学者研究表明，非酒精性脂肪肝细胞色素 P450 1A1(CYP1A1)基因及表达变化［2］、肝细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)基因及表达变化、肝细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因中c2基因及表达变化［3］与非酒精性脂肪肝发生发展的关系密切。

脂易消为长期临床实践中总结出来的临床效验方，主要由枳壳、半夏、泽泻、决明子、荷叶、鼠麹草等组成，有祛湿解毒、消痰散瘀、降脂抑脂之功效。长期临床观察和前期课题证实其疗效确切［4］，为临床治疗脂肪肝的有效方药。笔者现将脂易消对非酒精性脂肪肝CYP2E1基因表达的调控研究情况报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 将60只大鼠随机分成6组，每组10只。(1)正常对照组。给予标准饲料喂养，灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。(2)模型对照组。给予高脂饲料喂养，灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。(3)低剂量治疗组。给予高脂饲料喂养，灌服低剂量脂易消［相当于生药6 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(4)中剂量治疗组。简称中剂量组，给予高脂饲料喂养，灌服中剂量脂易消［相当于生药12 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(5)高剂量治疗组。给予高脂饲料喂养，灌服高剂量脂易消［相当于生药24 g/(kg·d)］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。(6)易善复对照组给予高脂饲料喂养，灌服易善复水溶液12 ml/kg［相当于6.92 mg/(kg·d)］，1次/d，共12周。第12周周末晚禁食16 h后，次日上午将实验大鼠以3%戊巴比妥钠按0.15 ml/kg腹腔内注射麻醉后，先腹主动脉取血约4 ml，之后剪开胸腔，取出肝脏，迅速在4℃生理盐水中冲洗后，于电子秤上秤重，然后在肝右叶中部切取数块肝组织液氮速冻后保存于－80℃以提取总RNA，用于检测肝细胞中CYP2E1 mRNA的表达。

1.2 技术方法 RT－PCR检测CYP2E1 mRNA表达。(1)总RNA提取。从－70℃冰箱中取出300 mg肝组织，用液氮将组织研磨成粉末，并加入Trizo 12 ml研磨，转移研磨好的液体到无RNA酶和无DNA酶的1.5 ml离心管中。然后加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡混匀30 s后，室温离心12 000 r/min×5 min;吸取上层水相溶液并转移至另一新鲜的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止5 min，再次室温离心12 000 r/min×5 min，弃上清，然后加入70%乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用0.05 ml DEPC去离子水重新溶解RNA。提取的总RNA经紫外线分光光度计测定提取物的浓度，A260/A280比值在1.8～2.0之间。(2)合成相关引物。根据核苷酸序列用Primer premier 5.0设计引物，提交上海生物工程有限公司进行合成，CYP2E1 mRNA引物序列如下:CYP2E1上游引物:5'－AGG GAG ACG CAG GTGT－3';下游引物:5'－CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA －3'，扩增片段368 bp。内参照β－actin上游引物:5'－ATG CCA TCC TGC GTC TG－3';下游引物:5'－ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT－3'，扩增片段578 bp。(3)逆转录反应。用上述细胞中提取的总RNA在下述反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下:5 × Buffer 5 μl、oligd(dT)10 pmol、dNTP(2.5 mM)4 μl、RNA 酶抑制剂 1 μl、M － MLV 逆转录酶 5 U。以DEPC水补齐至25 μl，轻轻混匀，室温放置10 min后移入42℃恒温槽中。42℃保温1 h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2 min。所得到的反应液即可用于PCR反应中作为逆转录反应液。(4)PCR反应。取上述逆转录反应产物于50 μl反应体积中进行PCR反应。反应体积组成如下:10 × Reaction Buffer 5 μl、4 种 dNTP 的混合物(每种 2.5 mM)2 μl、TaqDNA 多聚酶(3 μ/μl)、逆转录反应液3 μl、上下游特异引物各1 μl、去离子水35 μl。先在94 ℃预变性 5 min，然后按下述条件循环30次，变性94℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，最后72℃延伸5 min。(5)PCR产物分析。PCR产物5 μl经1%琼脂糖(含溴化乙锭溶液0.5 μg/ml)凝胶电泳2 h，另取3 μl Marker作为DNA片段大小的对照。凝胶电泳后，应用天能图像分析系统进行扫描，用BandScan分析，测定产物条带的吸光度值，以β－actin为基准，做半定量分析，即CYP2E1 mRNA的相对表达水平以CYP2E1/β－actin值表示。

2 结果

采用反转录PCR(RT－PCR)法检测肝组织CYP2E1 mRNA相对表达量。从肝组织CYP2E1相对表达量(V值)来看，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高(P＜0.01);脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组(P＜0.01)，而各剂量组大鼠与易善复组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA相对表达量(V值)(±s)

表1 各组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA相对表达量(V值)(±s)

注:与正常组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01

组别 例数CYP2E1 mRNA低剂量组 10 1.82±0.45△中剂量组 10 1.89±0.18△高剂量组 10 1.71±0.11△正常组 10 1.51±0.17模型组 10 3.69±0.46*易善复组 10 1.79±0.38△

3 结论

脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达细胞色素P450，是一组相对非特异性酶，广泛存在于机体内，但主要存在于肝细胞内质网上(微粒体)，负责外来物及某些体内代谢物质的生物转化，此酶可被某些化合物(包括药物)诱导或抑制，影响化合物在体内的代谢速度。在人的肝微粒体中，参与内源性物质和外源性物质(包括药物和环境污染物)代谢的细胞色素P450主要有CYP lA2、2E1和3A，其中CYP 2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。人和大鼠的CYP 2E1是由单基因调控，并且所有CYP 2E1的底物在人和动物中都是相同的。本课题结果显示，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高(P＜0.01);脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组(P＜0.01)，而各剂量组大鼠与易善复组无明显差异(P＞0.05)，表明脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达。脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达，可能是其防治非酒精性脂肪肝的重要作用机理之一。

［1］繆正秋．脂肪肝的防治［J］．宁波高等专科学校学报，1999，11(4):116．

［2］范建高，曾民德．脂肪肝的研究进展［J］．胃肠病学和肝病学杂志，1999，8(2):149 －151．

［3］Guan Y，Breyer MD．Targeting Peroxisome Proliferators－activated recePtors(PPARs)in kidney and urologic disease［J］．Minerva Urol Nefrol，2002，54:65 －79．

［4］卢书伟，蔡皓东，崔振宇．脂肪肝的药物治疗［J］．中国新药杂志，2001，10(12):76．