微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60－23免疫原性的研究＊

张 珍，刘春会，杜镇镇，王 冬

微小隐孢子虫感染引起的隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是一种全球性以腹泻为主要症状的人兽共患寄生虫病。筛选出免疫原性较强的基因片段，用于此病的免疫诊断、预防与治疗，是防治此病的主要手段之一［1］。有学者研究表明，微小隐孢子虫CP23基因编码的蛋白是宿主免疫识别的主要蛋白，能够刺激机体产生强烈的免疫反应；CP15/60、CP15等也以其较强的免疫原性，有望成为免疫诊断、免疫预防与治疗的靶抗原［2］。本课题前期研究中成功构建了重组表达质粒p ET－30a－23和p ET－30a－15/60－23复合基因载体，诱导表达了大量的重组蛋白 CP23 和 CP15/60－23［3］。为进一步观察重组蛋白CP23、CP15/60－23的免疫原性，将其配以免疫佐剂免疫小鼠，分别检测小鼠的体液和细胞免疫功能及抗隐孢子虫的感染能力，从而为人类隐孢子虫多价亚单位疫苗的研用提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠60只，雌雄各半，SPF级，体重14～16g，购于山东大学医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂与仪器 重组蛋白CP23和CP15/60－23由本实验室构建、表达和纯化；1640培养液（上海克隆生物高技术公司）；小牛血清（上海复旦天呈公司）；碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠IgG结合物及兔抗大鼠IgG结合物；小鼠IFN－γ、IL－12检测试剂盒均为晶美生物工程公司产品；MK3型酶标仪（芬兰Labsystems公司）；FC500型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫 BALB/c小鼠60只，随机分为3组，每组20只。分别为磷酸缓冲液（PBS）对照组、重组蛋白CP23免疫组、重组蛋白CP15/60－23免疫组。每只小鼠背部皮下多点注射弗氏完全佐剂和抗原混合物共100μL/只，对照组注射同量佐剂与PBS的混合物。每隔2w免疫1次，共免疫3次。每次免疫前剪尾取血，最后一次免疫2w后，75%的酒精消毒，摘眼球取血，收集血清，用于检测抗体及细胞因子。

1.2.2 小鼠特异性IgG抗体检测 采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体，包被抗原为大肠埃希菌表达的重组CP23蛋白、重组CP15/60－23蛋白。用1%小牛血清（BSA）封闭，不同稀释度各组免疫鼠血清、正常鼠血清为一抗、羊抗鼠IgG－AP结合物为二抗，对硝基苯基磷酸钠（p NPP）底物显色，酶标仪测吸光度（A405值）；检测孔A405＞2.1阴性对照（正常鼠血清）孔A405者判为阳性，计算血清IgG抗体滴度，动态检测免疫小鼠特异性抗CP23、CP15/60－23的抗体。

1.2.3 小鼠脾脏T细胞CD＋4、CD＋8亚群检测 末次免疫后2w，随机取各组BALB/c小鼠各5只，无菌取脾，制备脾细胞悬液，调整细胞数至5×106/m L，分别加入 FITC－CD3/PE－CD4 和 FITC－CD3/PE－CD8单抗，混匀后室温放置30 min后用流式细胞仪检测并计算T细胞亚群CD＋4、CD＋8的百分率和CD＋4/CD＋8比值。

1.2.4 小鼠细胞因子的检测 将脾细胞悬液浓度调至6.4×107/m L，分别滴入96孔无菌细胞培养板中，每孔0.2 m L，培养3 d后，收集上清。取培养液上清包被96孔反应板，常规ELISA法检测IFN－γ、IL－12。

1.2.5 卵囊攻击感染 第3次免疫2周后，将各组剩余BALB/c小鼠计45只（每组15只），分别灌胃接种1×106个卵囊，于接种第3 d开始收集小鼠粪便并称重，用简化的不连续蔗糖密度梯度离心法提取、纯化粪便中的卵囊，检测卵囊排出情况，计算平均每克粪便中卵囊数。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 10.0软件作统计学分析。各组间CD＋4、CD＋8百分率及细胞因子之间的比较用单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 IgG抗体滴度比较 随着免疫次数的增加，实验组小鼠免疫血清中IgG抗体滴度都逐渐升高，尤其是重组CP15/60－23免疫后血清中IgG抗体滴度升高更为明显，见表1。

表1 3次免疫后小鼠血清中IgG抗体平均几何滴度Tab.1 The dynamic results of IgG in serial serum of mice

2.2 T淋巴细胞百分率比较 第3次免疫后2w，小鼠脾脏T细胞CD＋4、CD＋8百分比及CD＋4/CD＋8都增高，与对照组相比均有显著性差异（P＜0.01），两实验组间差异无统计学意义，见表2。

表2 免疫后小鼠脾T细胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

表2 免疫后小鼠脾T细胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

※与对照组相比有差异，P＜0.05。

组 别CD＋4（%）CD＋8（%）CD＋4/CD＋8 PBS对照组24.18±3.30 9.92±1.14 2.44±0.16重组蛋白CP23组 44.02±2.29※ 14.98±1.05※ 2.95±0.29※重组蛋白CP15/60－23组 47.15±2.47※ 15.92±0.98※ 2.93±0.26※

2.3 细胞因子IFN－γ检测结果 单因素方差分析结果表明，经抗原刺激后的脾细胞培养上清中IFN－γ的滴度都有不同程度的增加，明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。重组蛋白CP23组IFN－γ平均几何滴度为8.98，重组蛋白 CP15/60－23组为16，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 细胞因子IL－12检测结果 单因素方差分析结果表明，经抗原刺激后的脾细胞培养上清中细胞因子IL－12的滴度都有不同程度的增加，与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。重组蛋白CP23组IL－12平均几何滴度为8.00，重组蛋白 CP15/60－23组为11.31，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 攻击感染后粪便卵囊比较 用微小隐孢子虫卵囊接种免疫后的小鼠，各组小鼠粪便中的卵囊数量都很低，实验组小鼠的潜伏期延长，卵囊排出期亦略缩短，各组之间无明显差异（P＞0.05），见图1。

图1 攻击感染后各组小鼠卵囊排出结果Fig.1 Comparison of oocysts shedding after challenge

3 讨 论

目前隐孢子虫感染的保护性免疫机制尚不清楚。有研究认为体液免疫和细胞免疫在抗隐孢子虫感染中都起一定作用，多数学者认为以细胞免疫为主，尤其CD＋4细胞的增加发挥很大作用，IFN－γ与IL－12亦可使卵囊排出减少，对抵抗感染起一定作用［4］。本研究结果用重组 CP23及 CP15/60－23抗原免疫小鼠后，小鼠脾脏T细胞CD＋4、CD＋8及CD＋4/CD＋8也增加，说明两种重组抗原体内都能刺激淋巴细胞增殖，尤其CD＋4T淋巴细胞的增殖更为明显。此研究结果还显示，随着免疫次数的增加，实验组小鼠免疫血清中IgG抗体滴度都逐渐升高，尤其是重组蛋白CP15/60－23组升高更为明显，并且两种重组抗原都可在体外刺激脾细胞产生大量的保护性细胞因子IFN－γ和IL－12。

本实验用卵囊攻击感染免疫后的小鼠，各组小鼠粪便中的卵囊数量都很低，各组之间无明显差异。这可能与感染动物的年龄因素有关，黄克和等［5］亦证实成年小鼠对隐孢子虫感染有抵抗性，而2w龄以内的小鼠则容易感染，本实验小鼠周龄均较长，因此皆不易受感染。

总之，本研究不仅证实CP23可被T细胞识别，是潜在的B细胞的免疫原，是增殖反应和血清学研究的理想对象［6］，还证实了联合重组抗原CP15/60－23也有很好的免疫活性，与重组CP23一样，体内能刺激机体产生高滴度的特异性抗体，刺激CD＋4淋巴细胞增殖，体外刺激脾细胞产生保护性细胞因子，两者都可以作为亚单位疫苗的理想侯选抗原，而且具有纯度高，制备简便等优点。有望研制出效果优异的亚单位疫苗以用于隐孢子虫病的预防。

［1］柏雪莲，张玉梅，周秀芝，等.微小隐孢子虫pcDNA3.0－23重组质粒免疫效果评价［J］.中国公共卫生，2010，26（8）：1007－1009.

［2］黄炳成，李瑾，魏庆宽，等.微小隐孢子虫重组 BCG－CP15/60－23疫苗免疫原性的研究［J］.中国病原生物学杂志，2008，3（12）：920－922.

［3］宰德富，张佃波，魏庆宽，等.微小隐孢子虫CP23基因的克隆及表达［J］.中国病原生物学杂志，2006，1（3）：193－196.

［4］Tessema TS，Dauber E，Petry F.Adoptive transfer of protective immunity fromCryptosporidiumparvum－infected interferon gamma and interleuk in－12－deficient mice to naive recipients［J］.Vaccine，2009，27（47）：6575－6581.

［5］黄克和，杨世广，唐建霞.从感染小鼠获得微小隐孢子虫卵囊方法的改进［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001，19（6）：360－362.

［6］Smith LM，Priest JW，Lammie PJ，et al.Human T and B cell immunoreactivity to a recombinant 23－k DaCryptosporidium parvumantigen［J］.J Parasitol，2001，87（3）：704－707.