金黄色葡萄球菌鉴别方法探讨

宋嵩文

广西壮族自治区玉林食品药品检验所，广西玉林 537000

金黄色葡萄球菌（SA）广泛存在自然界，是一种引起食物中毒的常见致病菌之一，目前很多国家都把金黄色葡萄球菌列为药品和食品卫生的法定检测项目[1]。对金黄色葡萄球菌检验目前采用的方法是以《中国药典》2010年版及食品安全国家标准GB4789.10-2010[2-3]。然而，SA在特殊环境中，可产生变异性，使细菌形态及典型的生化反应有所改变，在检验中常有假阳性发生，影响判断结果。本实验在常规方法的基础上增加API鉴定系统确认，能显著提高金黄色葡萄球菌检出率。因食品和药品对金黄色葡萄球菌检验方法类同，且食品相对于药品而言污染机率较大，杂菌较多，故实验以9批试验结果革兰染色镜检均为阳性的食品样品更具代表性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对照用菌株 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26 003]；样品菌株：两批生食鱼片（批号：SP20110189、SP20110212）、三批熟肉制品（批号：SP20110151、SP20110182、SP20110745）、两批豆制品（SP20110740、SP20110847）和两批盒饭（批号：SP20110108、SP20110073）共9个批次，革兰染色镜检试验均显阳性，计划监管中抽取于市场。

1.1.2 培养基和试剂 7.5%氯化钠肉汤；Baird-Parker培养基（B-P）；血琼脂平板；脑心浸出液（BHI）肉汤；营养琼脂斜面；冻干血浆；革兰染色试剂，广州环凯生物技术有限公司。API Staph 鉴定试条，法国生物梅里埃公司。

1.1.3 主要仪器设备 恒温培养箱，涡旋振荡器，显微镜，ATB-new微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 分离培养 按 GB/T4789.10-2010方法，无菌称取25 g样品加入225 mL灭菌的7.5%氯化钠肉汤中，均质后，（36±1）℃培养24 h，用取上述培养物，分别接种于Baird-Parker琼脂平板和血琼脂平板上，（36±1）℃培养24 h，培养结束后观察菌落生长特征。挑取1～2个可疑菌落，分别接种致营养琼脂斜面和BHI肉汤培养基中，置（36±1）℃培养24 h，同时进行革兰染色镜检。

1.2.2 血浆凝固酶试验 取冻干血浆1支，加入革兰染色镜检试验均显阳性的培养24 h的BHI肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，放置于37℃恒温培养箱中培养，每半小时观察1次，至少观察6 h。观察是否有凝块形成，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。同时用金黄色葡萄球菌及肉汤做对照试验。

1.2.3 API Staph 鉴定试条试验 取API Staph 鉴定试条，从营养琼脂斜面分离菌落，调节成相当于0.5麦氏标准浊度的均匀菌悬液，注入已有底物的各试管。并在装有精氨酸双水解酶（ADH）和尿酶（URE）管的杯内注入矿物油，用以隔绝空气保持厌氧环境。盖上培养盒，在（36±1）℃培养24 h后经ATB-new微生物鉴定系统鉴定。

2 结果

根据分离菌株的培养特性和革兰染色形态学观察、镜检、纯培养特性的观察、血浆凝固酶试验以及最终的API Staph鉴定条试验，确定样品中金黄色葡萄球菌阳性。见表1。

表1 9个批次样品试验结果

2.1 典型的金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上培养特性

菌落直径为2～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一条混浊带，在其外层有一透明圈，用接种针触动时，菌落有似奶油至树胶样硬度。

2.2 典型的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上培养特性

菌落较大，呈圆形，光滑突起、湿润，金黄色、光滑湿润、菌落周围可见完全透明的溶血圈。

2.3 典型的金黄色葡萄球菌革兰氏染色形态特征

革兰阳性球菌，圆形，呈单个短链和葡萄簇状或串状排列，无鞭毛、无芽孢、无荚膜。

2.4 典型的金黄色葡萄球菌纯培养生长特征

典型的金黄色葡萄球菌在脑心浸出液（BHI）肉汤中纯培养后呈混浊生长。

2.5 血浆凝固酶试验

典型的金黄色葡萄球菌能使血浆呈胶胨状凝固，将试管倾斜或倒置时，不能倒出，而阴性菌株和肉汤培养基均无凝固现象，以此来判定分离菌株血浆凝固酶试验为阳性。

3 讨论

金黄色葡萄球菌在适宜的条件下会产生一系列特征性的接触酶，其中包括纤维朊溶酶、玻璃酸溶酶、凝固酶和核酸酶。通过检测细菌是否分泌这些酶，可作为判断该菌株属种的重要指标之一[4]。传统的金黄色葡萄球菌鉴定是通过对样品增菌处理后，进行平板划线，然后，挑取可疑菌落进行形态、染色及血浆凝固酶试验后，进行判定。就血浆凝固酶试验而言，凝固酶基因曾被认为是鉴定金葡菌的特异性基因，但后来发现有少数金葡菌并不产生凝固酶[5]。据高屹[6]报道，血浆凝固酶试验呈阳性反应的有金黄色葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施莱福葡萄球菌凝固亚种、部分中间型葡萄球菌、海豚葡萄球菌及部分猪葡萄球菌等。凝固酶试验的血浆标准是必须含有足够浓度的凝固酶、反应因子和纤维蛋白原，必须无溶纤维蛋白活性和无抑制剂[7]，条件相对苛刻，并且多种因素对血浆凝固酶试验结果有一定的影响，如：培养物培养时间、血浆凝固酶的反应时间、所加培养物量的不同等，都会对血浆凝固酶的反应结果产生误差，当血浆凝固酶试验出现未完全凝集时，也不容易准确判定，容易造成漏检。据报导，使用API Staph 鉴定试条鉴定金黄色葡萄球菌，可使鉴定结果的准确性提高为93.6%[7]。表1实验结果表明，通过增加对分离的可疑金黄色葡萄球菌进行API Staph 鉴定试条试验，检测结果不但与国标法的显示阳性的检测结果是相一致的，还可对似阳非阳的结果进行判定，甚至对假阴性进行修正，防止漏检，明显提高了金葡菌的检出水平和准确性，对日常的检验工作具有很现实的指导意义，值得推广。

[1]陈彬，黄晓蓉，汤敏英，等.基因探针法快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究 [J].现代预防医学，2007，34（6）：1017-1021.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）[S].北京：中华医药科技出版社，2010：附录112-113.

[3]食品安全国家标准，食品微生物学检验GB 4789.10-2010[S].中华人民共和国卫生部，2010.

[4]吴美云，敖日格乐，王纯洁，等.牛粪中致病性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药物试验[J].江苏农业科学，2009（3）：250-251.

[5]姜延龙，张宇，田波，等.PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展[J].食品科学，2006，27（5）：265-269.

[6]高屹.细菌血浆凝固醉试验有几种?如何使用？[J]中华检验医学杂志，1999，22：35.

[7]方晓霞，陈维媚，王文天，等.Slidex Staph-kit和血浆凝固酶试验在金葡菌鉴定中的应用[J].中国微生态学杂志，2007，19（4）：393.