凋亡抑制蛋白Livin在上尿路移行细胞癌中的表达及其与预后的关系

吉日嘎拉，王 璠，余大海，鲍阿珉，乌云毕力格，王超奇，王 明，哈申高娃

（内蒙古民族大学附属医院1.泌尿外科；2.蒙医血液肿瘤科，内蒙古 通辽 028000）

凋亡抑制蛋白Livin在上尿路移行细胞癌中的表达及其与预后的关系

吉日嘎拉1，王 璠1，余大海1，鲍阿珉1，乌云毕力格1，王超奇1，王 明1，哈申高娃2＊

（内蒙古民族大学附属医院1.泌尿外科；2.蒙医血液肿瘤科，内蒙古 通辽 028000）

目的 检测Livin蛋白在人正常膀胱组织及上尿路移行细胞癌组织中的表达情况，并分析其表达与肿瘤临床分期、病理分级及肿瘤复发之间的关系。方法采用免疫组织化学法检测12例正常上尿路上皮组织切片及58例上尿路移行细胞癌组织标本及中Livin基因的表达情况。结果Livin蛋白在正常上尿路上皮组织中无表达，而在移行细胞癌组织中高表达，阳性表达率为60.3%。Livin蛋白在不同性别、年龄及是否伴有淋巴结转移患者中的表达差异无统计学意义（P＞0.05），而不同分期及分级的组间表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。随访9-45个月（平均29.3个月），肿瘤患者中共有27例出现局部或膀胱复发，总复发率为46.6%，其中Livin表达阴性组3年估计无瘤复发生存率为49.5%，而Livin表达阳性患者3年估计无瘤复发生存率为30.1%，二者之间差异显著（P＝0.04）。结论Livin在正常上尿路移行上皮组织中不表达，在上尿路移行细胞癌组织中高表达，Livin的表达与上尿路移行细胞癌分期、分级密切相关，与肿瘤复发密切相关。

Livin基因；上尿路移行细胞癌；免疫组化；肿瘤复发

（ChinJLabDiagn，2012，16：1845）

上尿路移行细胞癌是泌尿系统常见肿瘤性疾病，包括肾盂癌及输尿管癌，在所有成人肾脏肿瘤中占5%-10%［1］，治疗金标准为根治性肾输尿管切除术，术后需给予膀胱内化疗药物灌注预防肿瘤膀胱复发，但疗效并不确切，文献报道术后膀胱内复发率约为10%-55%［2，3］。因此，如何预防上尿路移行细胞癌术后复发成为人们研究的主要目标。近年来，关于上尿路移行上皮癌相关基因研究已成为热点，凋亡抑制基因可以抑制肿瘤细胞凋亡来促进肿瘤生长。而Livin基因是新近发现一种凋亡抑制基因，本研究通过检测上尿路移行细胞癌组织中Livin基因的表达情况来探讨其与肿瘤临床分期、病理分级及肿瘤复发之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取内蒙古民族大学附属医院泌尿外科2007年1月-2011年1月行手术治疗的上尿路移行细胞癌患者的石蜡切片。排除标准：①病理证实非上尿路移行细胞癌；②既往有其他系统恶性肿瘤病史。58例患者最终进入本研究，其中男性31例，女性27例，平均年龄62.7岁。根据2002年AJCC上尿路移行细胞癌TNM分期标准进行肿瘤分期：Ta期11例，T1期17例，T2期23例，T3期5例T4期2例。肿瘤分级采用1973年 WHO标准：G1级21例，G2级26例，G3级11。其中淋巴结转移5例，无远处转移病例。正常上尿道上皮组织切片来自上尿路良性疾病，共12例。

1.2 主要试剂UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒及DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司），山羊抗人Livin抗体（美国R＆D公司，）辣根酶标记的兔抗山羊二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 免疫组化免疫组化步骤按试剂盒要求进行。以PBS代替一抗作阴性对照，以试剂盒阳性片作为阳性对照。

1.4 结果判定Livin基因阳性表达结果定位于细胞胞质中。由两名观察者对所有切片进行双盲判断。当细胞胞质中出现棕黄、浅黄或棕褐色小颗粒时定义为阳性表达。根据着色强度的差异来记录分数：无着色：记0分，浅黄色：记1分，棕黄色：记2分，棕褐色：记3分。随机观察5个高倍视野，记录以上5个高倍视野中染色阳性细胞的平均百分率，记分标准如下：0%记0分，1%-10%记1分，11%-40%记2分，51%-70%记3分，＞70%记4分。染色强度记分结果与阳性细胞数记分之积为最后得分：0－1分为阴性，＞1分为阳性。以PBS代替一抗作为阴性对照

1.5 随访随访内容包括胸片，血常规、肾功能，尿脱落细胞，膀胱镜，CT等。术后一年内每3个月随访一次，第二年开始每半年一次。

1.6 统计学分析率的比较采用χ2检验，3年估计无瘤生存率采用Kaplan-Meier生存曲线计算，log-rank检验比较生存曲线。P＜0.05认为有统计学意义。应用SPSS10.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 细胞浆呈黄色至棕褐色为Livin蛋白阳性表达（图1） 58例患者中Livin表达阳性35例，阳性率为60.3%。12例正常上尿道移行上皮组织中无表达。

图1 Livin基因在膀胱癌中表达（A：PBS对照；B：阳性表达）

2.2 Livin蛋白在不同肿瘤分期、分级及淋巴结转移患者中的表达

Livin蛋白在不同性别、不同年龄组（以50岁为界将分为两组）患者中的表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。Ta阳性表达2例，T1阳性表达10例，T2阳性表达18例，T3阳性表达4例，T4阳性表达2例。各临床分期组别中Livin蛋白表达差有统计学意义（P＜0.05）。G1级患者中阳性表达8例，G2阳性表达19例，G3阳性表达8例，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。在伴有淋巴结转移组与无淋巴结转移患者组的比较中，Livin基因的表达的差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 Livin蛋白在不同分级、分级及淋巴结转移患者中的表达情况

2.1 Livin蛋白表达与肿瘤复发之间的关系

术后平均随访时间29.3（9-45）个月，共有27例出现肿瘤膀胱复发、局部复发或远处转移，其中Livin表达阴性组中有8例复发，3年估计无瘤生存率为49.5%，Livin表达阳性35例患者中有19例复发，3年估计无瘤生存率为30.1%，二者之间差异有统计学意义（（P＜0.05））（图2）。

图2 Livin表达阳性与阴性两组患者无瘤生存率比较

3 讨论

Livin位于人染色体20q13.3，包含7个外显子，6个内含子，全长共46kb［4］，是近年发现的人类凋亡抑制蛋白家族中的一个新成员，有研究表明livin蛋白抑制细胞凋亡主要通过抑制caspas-3及caspas-9的生物活性，进而促进肿瘤细胞的增值［5－7］。livin基因在仅在少数成年人的心脏、胎盘、脾、卵巢、肺等正常组织低表达，而在前列腺癌、膀胱癌、肾癌、白血病黑色素瘤、肺癌、及头颈部肉瘤等多种恶性肿瘤细胞中高表达［4，6－8］，目前，国内外文献中关于Livin基因在泌尿系肿瘤中表达的研究主要集中于膀胱移行上皮癌，尚无针对上尿路移行上皮癌的研究报告［9］。

本研究使用免疫组织化学染色方法得到Livin在上尿路移行细胞癌中的表达阳性率为60.3%，而正常尿路上皮中不表达，与李显文等采使用RTPCR法检测膀胱移行上皮癌得到的66.6%的阳性率相近［10］。这表明Livin蛋白在移行上皮癌中高表达。此外，在不同病理分期上尿路移行细胞癌中Livin蛋白表达情况的比较中，我们发现：Livin基因的表达与上尿路移行细胞癌的分期及分级密切相关，即随分级、分期增加，表达阳性率逐渐增加。但本研究中样本中T3、T4期患者数量较少，且总样本小，可能出现一定的偏倚。但我们的研究可充分提示Livin基因与上尿路移行细胞癌发生、发展密切相关，这表示Livin基因将来可能成为一项生物学指标来进行上尿路移行细胞癌的早期诊断。

国内、外多个Livin蛋白在膀胱移行细胞癌中表达的相关研究中，均未能完成通过对研究对象的随访来判断Livin基因表达与肿瘤复发的关系。而Mesallamy等通过急性白血病患者Livin基因表达的检测后认为在影响预后的相关因素分析中，Livin基因表达阳性是影响疾病预后的主要因素之一［11］。在本研究通过长期随访后发现共有27例患者出现肿瘤复发、转移，总肿瘤复发率为46.6%。Livin基因表达阳性患者3年估计无瘤生存率显著低于Livin表达阴性患者，我们可以认为Livin蛋白表达阳性与术后肿瘤的复发密切相关。因此，可通过检测患者Livin基因的表达的情况来制定术后肿瘤辅助治疗的具体方案及随访方案。

Wagener等通过Livin在肾脏肿瘤组织中的表达情况的研究后认为Livin基因可作为肾脏肿瘤治疗的靶点［12］。Crnkovic等认为RNA干涉技术可以用来抑制Livin基因的表达而使肿瘤细胞凋亡明显［13］。Purin等发现寡肽可以使Livin基因在肿瘤组织中的表达下调，促进肿瘤细胞的凋亡而达到治疗肿瘤的目的［14］。以上研究结果表明Livin可以作为肿瘤生物治疗的靶点，通过抑制Livin基因的表达来进行肿瘤的治疗。由于Livin基因在上尿路移行细胞癌中表达率较高，因此可以通过多种方法抑制Livin基因表达的方法来减少Livin基因在上尿路移行细胞癌中的表达，加速肿瘤细胞的凋亡，达到治疗肿瘤的目的，同时可用于术前肿瘤的降期及术后辅助治疗。目前国内外相关报道相对较少，有待于进一步研究。

［1］Morgan R，Richard Z，Juan P，et al.European guidelines for the diagnosis and management of upper urinary tract urothelial cell carcinomas：2011update［J］.Eur Urol，2011，59（4）：584.

［2］MatsuiY，Utsunomiya N，Ichioka K，et al.Risk factors for subsequent development of bladder cancer after primary transitional cell carcinoma of the upper urinary tract［J］.Urology，2005，65：279.

［3］Zigeuner RE，Hutterer G，ChromeckiT et al.Bladder tumour development after urothelial carcinoma of the upper urinary tract is related to primary tumour location［J］.BJU Int，2006，98：1181.

［4］Kosof G.M，Gomes B.C.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.J Biol Chem，2001，276（5）：3238.Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Biol，2000，10（21）：1359.

［5］Liu C，Wu X，Luo C，et al.Antisense oligonucleotide targeting Livin induces apoptosis of human bladder cancer cell via a mecha-nism involving caspase 3［J］.J Exp Clin Cancer Res.2010，29（3）：63.

［6］Li WQ，Li XL，Wang GP，Fu B.Gene expression of livin and survivin in adult patients with acute lymphoblastic leukemia and its clinical significance［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.2011.19（4）：921.

［7］程永贵，封 韬，王晓庆.Livin蛋白在肾细胞癌中的表达及其与预后的关系［J］.肿瘤学杂志，2012，18（3）：217.

［8］宋希双，张志伟，等.凋亡抑制基因Livin在膀胱癌中的表达及意义［J］.中华泌尿外科杂志，2006，27（4）：37.

［9］李显文，杨罗艳，王红珊，等.凋亡抑制蛋白Livin在膀胱移行上皮细胞癌中的表达及临床意义［J］.临床泌尿外科杂志，2006，21（3）：216.

［10］El-Mesallamy HO，Hegab HM，Kamal AM.Expression of inhib-itor of apoptosis protein（IAP）livin／BIRC7in acute leukemia in adults：Correlation with prognostic factors and outcome［J］.Leuk Res，2011，35（12）：1616.

［11］Wagener N，Crnkovic-Mertens I，Vetter C，et al.Expression of inhibitor of apoptosis protein Livin in renal cell carcinoma and non-tumorous adult kidney［J］.Br J Cancer，2007，97（9）：1271.

［12］Crnkovic-Mertens I，Hoppe-Seyler F，Butz K.Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the livin／ML-IAP／KIAP gene［J］.Oncogene，2003，22（51）：8330.

［13］Purin，Eller M.S，Byers H.R，et al.Telomere-based DNA damage response：a new approach to melanoma［J］.FA SEB J，2004，18（12）：1373.

The expression of Livin gene in upper urinary tract transitional cell carcinoma and its relation to the tumor relapse

JIRIGALA，WANGPang，YUDa-hai，etal.（1.DepartmentofUrology；2.DepartmentofMongolianHematology，AffiliatedHospitalofInnerMongoliaUniversityforNationalities，Tongliao028000，China）

ObjectiveTo assess the expression of Livin gene，a new member of the inhibitor of apoptosis protein family，in upper urinary tract transitional cell carcinoma（UTCC）and to indentified the relationship between tumor stage，tumor grade and relapse with its expression.MethodsImmunohistochemical staining for livin was performed using paraffin-embedded tissues from 58cases of UTCC and 12normal tissue of upper urinary tract.Disease-specific survival of patients was assessed，the differences between the immunohistologically livin-positive and livin-negative groups was compared with recurrence-free survival using the Kaplan-Meier method and log-rank test.ResultsOf the 58 UTCC specimens，35（60.3%）showed positive staining of Livin immunohistochemically.There is no expression in normal upper urinary tract tissues.The expression of Livin gene were statistically similar in different age，sex and lymph node metastasis status groups（P＞0.05）.Howerver，the positive expression rate of Livin gene of different tumor grade and stage groups showed a statistically difference（P＜0.05）.The mean follow up was 29.3months，the over all recurrence rate was 46.6%.For positive expression group，the 3-year estimate recurrence free survival rate was 30.1%，and 49.5%for the negtive expression group，the difference was significant（P＜0.05）.ConclusionLivin gene can be detected in UTCC tissues，and its expression is correlated with the tumor stage，grade and tumor relapse，it may be recognized as a biomarker of UTCC.

Livin gene；upper urinary tract transitional cell carcinoma；immunohistochemistry；tumor relapse

R737.1

A

1007－4287（2012）10－1845－04

＊通讯作者

2011－08－26）