荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

祝兴元，何谢玲，覃亚斌，马 菊，李梨平

（湖南省儿童医院 核医学科，湖南 长沙 410007）

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

祝兴元，何谢玲，覃亚斌，马 菊，李梨平＊

（湖南省儿童医院 核医学科，湖南 长沙 410007）

目的 用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒（HCMV）感染，并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果，与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%，其标准误为0.39，Kappa值为0.60；PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%，特异度为97.3%，Youden指数为0.957，PVP和PVN分别为0.961和0.989；pp65抗原检测用于检测 HCMV感染的灵敏度为59.2%，特异度为100%，Youden指数为0.592，PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性，诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高，而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。

巨细胞病毒；聚合酶链反应；pp65抗原

（ChinJLabDiagn，2012，16：0285）

人类巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒科B属的一种DNA病毒，极易引起胎儿、新生儿和婴幼儿急慢性感染，常影响多个脏器，对优生优育及儿童的健康影响极大。HCMV感染于胎儿和新生儿可表现为中枢神经系统损害和先天畸形，而在婴幼儿则多表现为器官疾病。活动性HCMV感染虽临床表现可为发热、咳嗽、贫血、腹泻及肝功能检查异常等，但均缺乏特异性，易误诊，因此早期准确诊断HCMV活动性感染有重要意义。HCMV感染的实验室诊断方法有多种：病毒培养、抗体检测、HCMV核酸检查、抗原检查等。但目前临床应用最多的是抗体检测、HCMV-DNA定量检测以及HCMV pp65抗原检测，后二种检测方法多用于诊断HCMV活动性感染。本文对后两种检测方法进行了比较研究，报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选自本院并于2008年10月至2010年2月血清CMV-IgMIgG双阳性或者IgG阳性儿童924名，其中男性儿童563名，女性儿童361名，年龄0～3岁。均对其进行全血HCMV-DNA荧光定量PCR检测及 HCMV-pp65抗原检测。临床CMV活动性感染的诊断依据是临床特征及中华医学会儿科学分会感染消化组1999年11月制定的巨细胞病毒感染诊疗方案［1］。

1.2 标本收集

每位受检儿童采集EDTA-K2抗凝静脉血5.0 ml，分成两份。其中一份2.0ml用于PCR检测，另一份3.0ml用于pp65抗原检测。

1.3 检测方法

1.3.1 全血HCMV-DNA定量PCR检测 将收集抗凝血以1 500rpm离心3min，弃上清。所得细胞沉淀采用TIANGEN BIOTECH 公司（北京）生产的血液基因组DNA提取试剂盒提取其中的DNA，严格按照操作步骤操作。全血HCMV-DNA分析试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司提供的人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒。该试剂盒选取人巨细胞病毒株-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区作为扩增靶区域，扩增片段长度为86bp。引物序列为Forward Primer：5’-GC TAACTATGCAGAGCATGTA-3’，Reverse Primer：5’-GCTGAGTTCTGGTAAAGAAC-3’，TaqMan Probe：5 ’-CTACATTGTACCCGAGGATAAGCG-3 ’。PCR扩增条件如下：93℃2min预变性，进入循环（1）93℃45s→55℃60s，10个循环，然后进入（2）93℃30s→55℃45s，30个循环。每次检测按试剂盒提供的定量阳性标准品做准曲线，同时设置阴性、空白对照。反应结束后，电脑自动计算定量结果。

1.3.2 HCMV-pp65 抗 原 检 测 应 用 HCMV-pp65抗原血症免疫荧光检测试剂盒检测人外周血多形核白细胞中的pp65抗原。抽取患儿外周静脉血3.0ml，2%EDTA-K2抗凝，用溶血素溶解血中红细胞，取2×105个细胞制片、固定和破膜，与高特异性鼠抗HCMV-pp65抗原单克隆抗体作用后，用FITC标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体染色，在荧光显微镜下观察结果。

1.3.3 结果判定 全血HCMV-DNA荧光定量PCR检测结果以全血HCMV-DNA拷贝数≥500为阳性；pp65抗原检测于荧光显微镜下观察HCMV-pp65阳性细胞的核呈均匀的苹果绿，结果以2×105个多形核白细胞中pp65抗原阳性细胞≥3个判为阳性。阳性及阴性质控品均由本实验室提供。

1.4 结果分析

运用统计学方法对所得结果进行处理和分析。

2 结果

2.1 全血HCMV-DNA荧光定量PCR与pp65抗原检测结果的比较见表1。

在924名被血清学检测HCMV阳性的儿童中，全血HCMV-DNA荧光定量PCR与pp65抗原这两种检测方法所得结果符合率为81.17%，其标准误为0.39，Kappa值为0.60。

表1 PCR检测与pp65抗原检测结果比较 例（%）

2.2 全血HCMV-DNA荧光定量PCR检测结果与患儿活动性HCMV感染的比较见表2。

PCR检测HCMV活动性感染的灵敏度为98.4%，特异度为97.3%，Youden指数为0.957。PVP（阳性预测值）和PVN（阴性预测值）分别为0.961和0.989。

表2 PCR检测结果与患儿HCMV感染的比较 例（%）

2.3 pp65抗原检测结果与患儿活动性HCMV感染的比较见表3。

pp65抗原检测用于检测HCMV活动性感染的灵敏度为59.2%，特异度为100%，Youden指数为0.592。PVP和PVN分别为1.00和0.782。

表3 pp65抗原检测与患儿HCMV感染的比较 例（%）

3 讨论

诊断HCMV感染的方法有多种。其中细胞培养分离巨细胞病毒为诊断HCMV感染的“金标准”，但所需时间长。pp67-mRNA检测能快速客观的诊断HCMV活动性感染，是HCMV活动性感染最可靠的指标，但pp67-mRNA可能只在部分HCMV患者中检出［2］，故应用于临床诊断有待探讨。HCMV-IgG亲和力指数（HCMVIgG-AI）的检测可鉴别CMV原发感染和复发感染，准确度高，快速简便。IE-mRNA 和 L-mRNA 的检测能辅助 诊 断CMV活动性感染，且在感染病毒后被检出时间较pp65抗原检出时间要早。这些方法因成本高，难于标准化，目前只用于科研。血清学检测、HCMVDNA PCR及pp65抗原检测是临床常用的3种方法，血清学检测采用市售的ELISA试剂盒，该法操作简单，经济，所需时间短，可用于普查，在新生儿及小于3岁的幼儿检测时因其产生抗体能力较弱，可能出现假阴性结果，也可与其他疱疹类病毒感染发生交叉反应出现假阳性。而全血 HCMV-DNA PCR检测与pp65抗原检测有较高的特异性，且不受患者年龄及免疫能力的影响，是诊断活动性感染的较好指标，适用于小儿HCMV感染的监测。

本研究显示，用全血HCMV-DNA PCR和pp65抗原检测HCMV的活动性感染，结果有较好的一致性，符合率为81.17%。前者灵敏度较后者要高，特异度则后者较前者高，达到了100%。这与Elisabetta Cariani及李易娟等人的研究结果相一致［3，4］。

实时荧光定量PCR解决了以往PCR期间及PCR之后产物的污染问题，其灵敏度，特异度，阳性预测值及阴性预测值均令人满意。我们研究的全血HCMV-DNA荧光定量PCR检测的特异度与阴性预测值与许贤林等人的研究结果相近（分别为97.3%和0.989VS 93.8%和0.978），且灵敏度及阳性预测值较高（分别为98.4%和0.961VS 87.5% 和 0.700）［5］。 有 研 究 显 示 全 血 HCMVDNA拷贝数与HCMV感染发生次数有一定的关系［6］：全血 HCMV-DNA拷贝数高的患者更易反复发生HCMV血症，并且HCMV病的发生率也随之增高。因此全血 HCMV-DNA PCR检测可用于HCMV活动性感染的监测。

HCMV的表达是极早期、早期和晚期蛋白基因连锁相继表达，这些蛋白均属抗原。极早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白分别于感染后1－3h、3h和6－24h出现在感染细胞核内。晚期蛋白除了可出现于感染细胞核内还可出现于感染细胞胞浆中［7］。pp65抗原属于晚期蛋白之一，是一种低基质磷蛋白，在病毒活跃复制时利用单克隆免疫荧光抗体检测方法可在外周血多形核细胞（PMNL）核内检出，HCMV-pp65阳性细胞是病毒在细胞内活动性复制的感染细胞，其检出代表病毒血症。

pp65抗原检测已成为国际公认的诊断HCMV活动性感染的标准方法，并可根据抗原的阳性细胞数目预测HCMV病的发生和治疗效果。但该检测方法操作繁杂且受到PMNL数量、技术操作及人为因素影响难于标准化，在白细胞减少的患者中容易出现假阴性［8］。在我们的研究中有375例患儿临床诊断为HCMV活动性感染，而pp65抗原检测阳性率低于全血HCMV-DNA荧光定量PCR检测，可能与患儿白细胞数量低有关；也有可能与学者们研究发现CMV-DNA荧光定量PCR与CMV-pp65抗原检测这两种方法首次出现阳性的时间有关，Carlos Solano等认为前者较后者约早出现一周［9］，邱江等认为有13.5天［10］。在对本研究患儿队列的监测中也有类似发现，在儿童中二者检测阳性出现时间的比较正在研究中。

总之在本研究中全血 HCMV-DNA PCR与HCMV-pp65抗原检测的结果有较好的一致性，其敏感性和特异性高，操作比pp65抗原检测简便，可标准化及自动化，更适合临床广泛开展，成为诊断HCMV活动性感染的检测指标，指导临床用药、监测疗效及评定预后。

［1］中华医学会儿科学分会感染消化组.巨细胞病毒感染诊断方案［J］.中华儿科杂志，1999，37（7）：441.

［2］白 剑，石炳毅，肖 漓等.器官移植受者外周血中人巨细胞病毒pp67-mRNA的 RT-PCR 检 测 ［J］.中 国 误 诊 学 杂 志，2008，8（36）：8821.

［3］Elisabetta Cariani，Caterina P Pollara，Barbara Valloncini，et al.Relationship between pp65antigenemia levels and real-time quantitative DNA PCR for Human Cytomegalovirus（HCMV）management in immunocompromised patients［J］.Journal List，2007，7（138）：2334.

［4］李易娟，曾 瑜，庄思齐等.不同实验方法在诊断和监测新生儿先天性巨细胞病毒感染中的临床研究［J］.中华围产医学杂志，2005，8（3）：187.

［5］许贤林，何小舟，罗光华等.RT-PCR检测肾移植术后血浆、尿及白细胞中巨细胞病毒感染的临床意义［J］.江苏医药，2006，32（8）：713.

［6］陈育红，赵晓甦，刘开彦等.造血干细胞移植后患者血浆巨细胞病毒DNA拷贝数与巨细胞病毒病的关系［J］.中华医学杂志，2009，89（22）：1540.

［7］段凤英，吴明昌.婴儿巨细胞病毒感染的诊断［J］.中国医刊，2009，44（6）：75.

［8］杨 菁，王 东.人巨细胞病毒被膜磷蛋白PP65的检测及其在肾移植受者HCMV诊断中的临床应用［J］.南方医科大学学报，2008，28（2）：263.

［9］Carlos Solano，Isabel Munoz，Antonio Gutierrez，et al.Qualitative Plasma PCR Assay（AMPLICOR CMV Test）versus pp65Antigenemia Assay for Monitoring Cytomegalovirus Viremia and Guiding Preemptive Ganciclovir Therapy in Allogeneic Stem Cell Transplantation［J］.Journal of Clinical Microbiology，2001，39（11）：3938.

［10］邱 江，陈立中，马 毅等.实时定量PCR方法监测肾移植患者血浆巨细胞病毒DNA载量及其意义［J］.中华实验外科杂志，2008，25（5）：638.

Comparison of the performances of fluorescence quantitative PCR and PP65antigenemia assay in detection of active HCMV infection in children

ZHUXing－yuan，HEXie-ling，QINGYa-bin，etal.（HunanChildren＇sHospitalDepartmentof NuclearMedicine，Changsha410007，China）

ObjectiveTo compare the performances of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR）and pp65antigenemia assay in diagnosis of human cytomegalovirus（HCMV）infection.MethodsComparing the results of whole blood HCMV-DNA PCR and HCMV-pp65antigenemia assay for 924children whose HCMV serological test is positive，and analyzing the coincidence degree of the test results with the clinical diagnosis.ResultsThe consistent rate of whole blood HCMV-DNA PCR test and pp65antigenemia assay was 81.17%，standard error was 0.39，value of Kappa was 0.60；the sensitivity of PCR test for detection of HCMV infection was 98.4%，the specificity was 97.3%，Youden index was 0.957，PVP and PVN were 0.961and 0.989，respectively；the sensitivity of pp65antigenemia assay for detection of HCMV infection was 59.2%，the specificity was 100%，Youden index was 0.592，PVP and PVN were 1.00and 0.782，respectively.ConclusionGood agreement（κ＝0.6）was found between HCMV-DNA PCR test and pp65antigenemia assay.The sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR in detection of HCMV infection was much higher than that of pp65antigenemia assay，while the specificity of the latter was higher than the former.Both of the two methods can be used for the diagnosis of HCMV active infection.

human cytomegalovirus；polymerase chain reaction；pp65antigen

R373.9

A

1007－4287（2012）02－0285－03

＊通讯作者

2011－04－17）