LHRH-PE40诱导分化胃癌细胞凋亡的研究

姜 洋，田小川，崔春国，王凌燕，朱 平

（1.吉林大学中日联谊医院a.结直肠外科；b.乳腺外科；c.心血管内科，吉林 长春 130033；2.解放军军事医学科学院11所）

LHRH-PE40诱导分化胃癌细胞凋亡的研究

姜 洋1a，田小川1a，崔春国1b，王凌燕1c＊，朱 平2

（1.吉林大学中日联谊医院a.结直肠外科；b.乳腺外科；c.心血管内科，吉林 长春 130033；2.解放军军事医学科学院11所）

目的 研究 NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA及其蛋白在诱导分化BGC-823细胞中的表达，探讨LHRH-PE40与胃癌细胞凋亡的关系。方法应用RT-PCR、Western blot法检测BGC-823细胞中NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表达及其蛋白的表达情况。结果LHRH-PE40诱导BGC-823细胞凋亡时，NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA表达水平有所增加，NF-κB P65和Caspase-3P20活性片段也增加。结论LHRH-PE40可以诱导胃癌细胞内NF-κB的活化；引起Caspase-3级联反应，促进细胞凋亡。

LHRH-PE40；胃癌，细胞凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0221）

LHRH-PE40作为毒性部分的绿脓杆菌外毒素A（PE40）进入细胞质，通过抑制蛋白质合成杀伤靶细胞［1，2］。由实验证实，LHRH-PE40作为一种免疫毒素不但杀伤细胞，同时能够促进细胞凋亡。核转录因子-κB（NF-κB）在细胞凋亡中起着重要作用；Caspase-3是凋亡的关键酶和执行者，在各种细胞中均有表达。本研究应用RT-PCR、Western blot法，研究 NF-κB mRNA 和 Caspase-3mRNA 及其蛋白在LHRH-PE40诱导分化BGC-823细胞中的表达，旨在探讨NF-κB和Caspase-3与胃癌细胞凋亡的关系。

1 材料和方法

1.1 BGC-823细胞的收集及裂解

BGC-823细胞株，由长春基因工程药物研究所提供。① 弃培养液，洗细胞。② 每孔加入1ml PBS，用细胞刮将细胞刮下转移至离心管中离心。③ 向离心管中加入细胞裂解液煮沸，离心。

1.2 实验分组

实验对象分2组：正常BGC-823细胞组；0.2 μg／ml LHRH-PE40诱导BGC-823细胞48h组。

1.3 蛋白质含量的测定—免疫印迹法（Western blot）

①提取蛋白质样品，沉淀，冷却，离心后取上清。②转膜。③洗涤，漂洗，夹滤纸中，待照相记录，分析结果。

1.4 目的基因mRNA的表达

利用Trizol法将BGC-823细胞提取总RNA后，测定RNA纯度及含量，A260／A280约在1.8－2.0之间，基本无蛋白质污染。RNA经电泳后，可见28SRNA：18SRNA约为2∶1。mRNA反转录合成cDNA第一链，扩增β-actin基因。将其电泳，观察、摄片。测定各组 NF-κB P65和 Caspase-3mRNA RT-PCR产 物 灰 度 与 内 参 照 β-actin mRNA RTPCR产物灰度的比值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA的表达

在两组BGC-823细胞中均有 NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表达，其平均相对表达水平见表1，RT-PCR 电泳结果见图1、2。0.2μg／ml LHRH-PE40 干 预 组 BGC-823 细 胞 NF-κB P65 mRNA、Caspase-3mRNA相对表达水平明显升高，与正常对照组比较，有显著差异（P＜0.001，P＜0.01），说 明 LHRH-PE40 能 引 起 BGC-823 细 胞NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表达上调，促进细胞凋亡。

表1 每组 NF-κB mRNA、Caspase-3mRNA的表达量（±s，n＝6）

表1 每组 NF-κB mRNA、Caspase-3mRNA的表达量（±s，n＝6）

P＜0.01，vs Control

Group NF-κB P65／β-actin Caspase-3／β-actin Control 0.39±0.03 0.92±0.47 LHRH-PE40 0.81±0.07＊ 1.78±0.36＊

图1 每组NF-κB mRNA的表达量

图2 每组Caspase-3mRNA的表达量

2.2 NF-κB P65、Caspase-3P20的表达

在2组 BGC-823细胞中均可见 NF-κB P65、Caspase-3P20表达，见图3、4。0.2μg／ml LHRHPE40干预组 BGC-823细胞 NF-κB P65、Caspase-3 P20活性片段条带与正常对照组相比，有明显增粗，说 明 LHRH-PE40 能 引 起 BGC-823 细 胞 NF-κB P65、Caspase-3P20活性片段增加，促进细胞凋亡。

图3 每组NF-κB P65的表达量

图4 每组Caspase-3P20的表达量

3 讨论

LHRH-PE40细胞毒性部分为PE40，将PE分子的Ⅰa去除，就形成了PE40。毒素一旦进入细胞质，通过灭活28srRNA，阻止延长因子-2和60s核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成［3］。通过实验证实，LHRH-PE40对肿瘤细胞进行杀伤的同时，又会促进细胞凋亡。

NF-κB如同第二信使可以传递上游信号，从应激触发、信号作用于细胞膜受体到NF-κB活化进入细胞核内的过程是一个相互调节、相互影响的信号转导系统。有学者认为NF-κB是一种促凋亡因子，NF-κB的激活可以促进某些细胞系的凋亡［5］；也有学者认为NF-κB可以通过诱导细胞表达TNF受体结合分子（TRAF1、TRAF2）和凋亡抑制蛋白（IAP），抑制Caspases的级联反应，进而阻断TNF受体／Fas介导的调亡信号的转导，来抑制细胞凋亡的发生［4］。本研究结果显示：0.2μg／ml LHRHPE40能使NF-κB P65mRNA及其蛋白表达明显增加，该浓度下，BGC-823细胞凋亡指数较高。

Caspase-3是各种细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是凋亡的关键酶和执行者，同时也是许多细胞凋亡的重要效应蛋白，故又称之为“死亡蛋白”［6］。发生的凋亡作用主要表现为：①直接破坏细胞结构；②灭活凋亡抑制因子；③调节酶蛋白、裂解其效应功能区域［7］。本实验发现通过激活NF-κB，进一步活化Caspase-3途径诱导诱导BGC-823细胞凋亡。

本研究对能促进凋亡产生的关键酶Caspase-3 mRNA及其蛋白进行检测，结果显示：LHRH-PE40诱 导 BGC-823 细 胞 凋 亡 时，NF-κB mRNA 和Caspase-3mRNA 表 达 水 平 有 所 增 加，NF-κB P65和Caspase-3P20活性片段也增加。因此，本研究认为，LHRH-PE40作用BGC-823细胞，可以产生作为凋亡应激原的细胞因子而启动凋亡程序，使NF-κB P65活化，最终会通过 Caspase-3途径而引起细胞凋亡；同时本研究也认为，通过NF-κB使Caspase-3激活只是LHRH-PE40介导胃癌细胞凋亡的一条重要途径，但可能不是唯一的，LHRHPE40介导胃癌细胞凋亡还可能通过不依赖Caspase-3的其他途径进行。

［1］Endo Y，Mitsui K，Motizuki M，et al.The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes.The site and the characteristics of the modification in 28Sribosomal RNA caused by the toxins［J］.J Biol Chem，1987，262（12）：5908.

［2］Szepeshazi K，Schally AV，Halmos G.LH-RH receptors in human colorectal cancers：unexpected molecular targets for experimental therapy［J］.Int J Oncol，2007，30（6）：1485.

［3］Dunn RD，Weston KM，Longhurst TJ，et al.Antigen binding and cytotoxic properties of a recombinant immunotoxin incorporating the lytic peptide，melittin ［J］.Im munotechnology，1996，2（3）：229.

［4］Baichwal VR，Baeuerle PA.Activate NF-kappa B or die［J］.Curr Biol，1997，7（2）：R94.

［5］Wang CY，Mayo MW，Korneluk RG，et al.NF-kappa B antiapoptosis：induction of TRAF1and TRAF2and c-IAP1and c-IAP2to suppress caspase-8activation ［J］.Science，1998，281（5383）：1680.

［6］Bonavia R，Bajetto A，Barbero S，et al.HIV-1Tat cause apoptotic death and calcium homeostasis alteration in rat neurons［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，288（2）：301.

［7］彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床［M］.北京：人民卫生出版社，2000：83－84.

LHRH-PE40differentiation stomach cancer cell apoptosis of research

JIANGYang，TIANXiao-chuan，CUIChunguo，etal.（China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveStudy the NF-κB mRNA and Caspase-3mRNA and protein in the differentiation BGC-823 cells，is to explore the expression LHRH-PE40and gastric cancer cell apoptosis relationship.MethodsApplication RTPCR，blot method to detect that BGC-823cells in the NF-κB mRNA，Caspase-3mRNA expression and its protein expression.ResultsLHRH-PE40induction BGC-823cell apoptosis，the NF-κB mRNA and Caspase-3mRNA expression level increases，the nf-kappa B P65and Caspase activity-3pieces also increases.ConclusionLHRH-PE40can induce gastric cancer cells the nf-kappa B activation；Cause Caspase-3cascade，promote cell apoptosis

LHRH-PE40；Apoptosis；Stomach cancer

R735.2

A

1007－4287（2012）02－0221－03

＊通讯作者

2010－12－19）