外周血生存素的表达与胃癌生物学行为相关性研究

刘金龙，邬淑雁，刘丽红，于爱军，张学军，孙志德

（承德医学院附属医院 普外一科，河北 承德 067000）

外周血生存素的表达与胃癌生物学行为相关性研究

刘金龙，邬淑雁，刘丽红，于爱军，张学军，孙志德

（承德医学院附属医院 普外一科，河北 承德 067000）

目的 以反转录－聚合酶链式反应－酶联免疫测定（RT-PCR-ELISA）方法，检测胃癌患者外周血中生存素基因的表达。并分析其与胃癌生物学行为的关系，探讨其作为评价胃癌生物学行为及预后检验指标的可能性。方法收集53例胃癌患者外周血，以RT-PCR-ELISA方法检测胃癌患者外周血中生存素mRNA的表达，比较其是否与肿瘤部位、大小、浸润深度、分化程度、淋巴结转移和临床分期具有相关性。结果53例胃癌外周血中60.4%（32例）生存素mRNA表达阳性。肿瘤＞5cm及≤5cm生存素mRNA表达率分别为78.3%、46.0%。浸润深度达浆膜层者外周血生存素mRNA表达率74.2%，高于侵及黏膜下层及肌层的表达率（33.3%），淋巴结有转移者外周血表达率为75.0%，高于无淋巴结转移的表达率（29.4%）。结论生存素mRNA在外周血的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和临床分期均有明显相关性，但与肿瘤部位、分化程度无明显相关。外周血生存素的表达可作为评价胃癌生物学行为及预后的参考指标。

生存素；胃癌；反转录－聚合酶链式反应；酶联免疫测定；外周血

（ChinJLabDiagn，2012，16：0057）

凋亡蛋白抑制因子（inhibitors of apoptosis protein，IAP）是一族凋亡抑制蛋白，生存素（survivin）是新近发现的IAP家族成员之一，但具有不同于IAP家族其他成员的独特结构和性质［1］。已有研究表明，survivin不仅在多种人类肿瘤中有异常表达，且与肿瘤预后不良的病理参数有关［2－4］。本研究通过检测外周血生存素mRNA的表达，旨在探讨生存素的表达与胃癌生物学行为及预后的关系。

1 标本来源和方法

1.1 标本来源

血液标本取自2007年6－12月我院外科的53例胃癌手术患者。术前均未接受过化疗或放疗。诊断均经术后病理检查证实。其中男30例，女23例；年龄30－75岁，平均62岁；高分化腺癌6例，中分化腺癌13例，低分化腺癌20例，未分化腺癌10例，中分化鳞癌1例，低分化鳞癌2例，中分化类癌1例；有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者17例。

1.2 取材及试剂

外周血为术前外周静脉抽血，置－80℃保存。Survivin信息核糖核酸检测试剂盒购自四川新创生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 反转录－聚合酶链式反应 采集1ml静脉血于抗凝管中，4℃3 000rpm离心10min收集细胞沉淀，用Trizol试剂提取细胞沉淀中的总RNA，用逆转录试剂盒按厂商说明合成cDNA，用特异的荧光素标记引物对生存cDNA（来自血液中的游离肿瘤细胞）进行PCR扩增。扩增产物，即荧光素标记的生存素DNA片段。生存素转录物的PCR扩增采用顺向引物序列为5′-GGC ATG GGT GCC CGG ACG TT-3′及逆向引物序列为5′-AGA GGC CTC AAT CCA TGG CA-3′。循环参数为94℃预变性3min，94℃变性1min，62℃复性1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃延伸10min。产物为439bp的部分生存素DNA序列片段。

1.3.2 酶联免疫测定 96孔杂交板的包被底物为439bp生存素DNA序列片段中一段338bp片段作为探针。用NaOH变性荧光素标记的生存素标准和血样PCR产物并与包被片断杂交，50℃保温2小时，洗去未杂交的核酸，用抗荧光素－HRP结合物测定杂交的生存素扩增产物，显色反应底物TMB，以酶标仪读取A450／630。通过直线回归比较计算扩增的生存素cDNA相对含量。

1.4 统计学分析

应用spss13.0统计分析软件，定性资料以百分率表示，组间差异的分析采用χ2检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

胃癌外周血中生存素表达结果见表1。53例胃癌外周血中60.4%（32例）生存素mRNA表达阳性。肿瘤＞5cm患者30例，≤5cm患者23例.肿瘤＞5cm生存素mRNA表达率78.3%，远高于肿瘤≤5cm的胃癌患者（46%），P＝0.021，有统计学意义。

表1 生存素的表达与胃癌临床病理特征的关系

浸润深度达浆膜层者外周血生存素mRNA表达率74.2%，高于侵及黏膜下层及肌层的表达率（33.3%），P＝0.004，有统计学意义。淋巴结有转移者外周血表达率为75.0%，高于无淋巴结转移的表达率（29.4%），P＝0.002，有统计学意义。

胃癌低及未分化外周血生存素mRNA表达率（68.8%）虽高于高中分化表达率（47.6%），但无统计学意义（P＞0.05）。病灶位于贲门、胃体、胃窦表达率分别为61.5%、66.7%、56.0%，P＝0.671，无统计学意义。

胃癌外周血中生存素表达阳性率与胃癌分期之间的关系见表2。胃癌病理分期按照抗癌国际联盟（UICC）TNM方案分期（1997年第五版）。Ⅰ期患者9名，Ⅱ期患者18名，Ⅲ期患者21名，Ⅳ期患者5名。随病期越晚，外周血中生存素表达阳性率越高，Ⅰ、Ⅱ期患者表达率较低，分别为33.3%、38.8%，相差较小；Ⅲ、Ⅳ期表达率较高，其中Ⅳ 期患者5例均有表达，阳性率为100%。

表2 生存素的表达与胃癌临床病理分期的关系

综上所述，生存素mRNA的表达与胃癌大小、浸润深度、淋巴结转移、病期均具有明显相关性（P值均小于0.05），而与胃癌的分化程度及肿瘤的部位无明显相关性（P值大于0.05）。

3 讨论

生存素（Survivin）是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，survivin的高表达能抑制多种因素如p53、半胱天冬酶（caspase）等诱导的细胞凋亡［5］，其在多数实体肿瘤中存在高表达，如 Miyachi［6］对107名胃癌病人应用实时PCR方法检测其癌组织和非癌组织中Survivin mRNA的表达，结果显示，癌组织中105例有Survivin表达，且生存素有报道证实并不在血细胞中表达［7，8］。所以生存素有可能是具有较高敏感度及特异度的非常理想的外周血中癌细胞标志物。

RT-PCR是目前检测癌细胞敏感度较高的一种方法，其在测定血中一种或多种肿瘤标志物的信息核糖核酸，以确定血中是否有游离癌细胞中已得到广泛应用。虽然现今采用的肿瘤标志物肿瘤特异性不高，但很多却具有组织特异性。比如CEA来自上皮细胞，SCC来自鳞状细胞，PSA来自前列腺，AFP来自肝脏。因此如果在血细胞中检测到这些肿瘤标志物的信息核糖核酸，就表明血细胞中有来自这些组织或脏器的癌细胞。这些文献报道的大多数都认为用反转录－聚合酶链式反应方法检测血中是否有游离癌细胞能够用来进行癌症转移和复发的早期诊断，预后的判断和治疗的监测。

本研究中所应用的RT-PCR-ELICA检测方法敏感度较普通RT-PCR不但敏感度更高，有更高的特异性，可重复性强，且操作简单［9］。外周血查肿瘤标志物提示癌细胞血行转移已被证实为一种安全可行的癌症早期诊断方法。

本研究通过分析外周血生存素的表达与胃癌主要临床病理特征的关系，发现生存素mRNA在外周血的表达与肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移，病理分期均有明显相关性，但与肿瘤部位、分化程度无明显相关，本研究中胃癌低及未分化外周血生存素mRNA表达率虽高于高中分化表达率，但无统计学意义，可能与本研究样本量较小有关。

［1］李金贵，胡自力.存活素基因与肿瘤的研究现状［J］.国际检验医学杂志，2007，28（5）：462.

［2］Nassar A，Sexton D，Cotsonis G，et al.Survivin expression in breast carcinoma：correlation with apoptosis and prognosis［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2008，16（3）：221.

［3］张 琨，蒋春晓，高 峰，等.生存素基因及在白血病研究中的应用［J］.中国实验诊断学，2005，9（6）：1020.

［4］Sohn DM ，Kim SY，Baek MJ，et al.Expression of survivin and clinica1correlation in patients with breast cancer［J］.Biomed Pharmacother，2006，60：289.

［5］Ambrosini G，Adida C，Ahieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.Nat Med，1997，3：917.

［6］Miyachi K，Sasaki K，Onodera S，et al.Correlation between survivin mRNA expression and lymph node metastasis in gastric cancer［J］.Gastric Cancer，2003，6：217.

［7］Moriai R，Asanuma K，Kobayashi D，et al.Quantitative analysis of the anti-apoptotic gene survivin expression in malignant haematopoietic cells［J］.Anticancer Res，2001，21：595.

［8］Mehes G，Witt A，Kubista E，et al.Circulating breast cancer cells are frequently apoptotic［J］.Am J Pathol，2001，159：17.

［9］Shang-Mian Yie，Bie Luo，Nai-Yao Ye，et al.Detection of survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of breast cancer patients by a RT-PCR ELISA［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23：279.

Expression of Survivin in the Peripheral Blood of Patients with Gastric Cancer and Its Relationship with Biological Behav- iors of Gastric Cancer

LIUJin-long，WUShu-yan，LIULi-hong，etal.（Dept.ofGeneralSurgery1，TheAffiliated HospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China）

ObjectiveReverse transcriptase polymerase chain reaction and enzyme-linked immuneoassay（RT-PCRELISA）was used to assess the expression of survivin mRNA in the peripheral blood of patients with gastric cancer.We investigated it’s relationship with biological behaviors of gastric cancer to discuss the possibility of being a method to evaluate the prognosis of gastric cancer.Methodsthe peripheral blood was collected from 53patients with gastric cancer.RT-PCR-ELISA was used to assess the expression of survivin mRNA in the peripheral blood of patients with gastric cancer.Calculate the dependability between the expression and the sites，size，infiltration，degree of tumor differentiation，lymph node metastasis and clinical stages.ResultsThe expression rate of survivin mRNA in the peripheral blood of the 53cases of patients with gastric cancer is 60.4%（32cases）.The expression rate for the tumor size＞5cm and≤5cm is according to 78.3%、46.0%。The expression rate of patients whose plasma membrane were infiltrated is 74.2%，which is higher than others（33.3%）.when there was lymph node metastasis，the expression rate is 75.0%，which is higher than the rate when there was no lymph node metastasis（29.4%）.ConclusionThe expression of survivin in the peripheral blood was related with the size，infiltration，lymph node metastasis and clinical stages，but was not correlated with sites or the degree of tumor differentiation.The expression of survivin in the peripheral blood might be a referenced indicator in evaluating the biological behaviors and prognosis of gastric cancer.

Survivin；Gastric cancer；Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Enzyme-linked immunoassay；Peripheral blood

R735.2

A

1007－4287（2012）01－0057－03

2010－12－25）