抗心磷脂抗体IgG时间分辨荧光免疫分析法的建立

胡志刚，刘 洁，叶 燕，陈国千，邹耀红，俞 蕾

（南京医科大学附属无锡市人民医院1.检验科；2.呼吸科；3.风湿科，江苏 无锡 214023）

抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为靶抗原的自身抗体。ACA常见于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，与血栓形成、自然流产或宫内死胎关系密切［1－3］。在自身免疫反应过程中，ACA的变化以IgG为主［4］。目前对ACA的检测主要方法为酶联免疫分析法［3，5］。酶联免疫分析为大分子有活性的酶标记，在灵敏度、线性范围和稳定性方面有所欠缺，此外，测量精度也不够高［6，7］。建立灵敏、稳定、线性范围宽、便捷的 ACA检测方法有重要临床意义。本试验采用ACA抗原（心磷脂＋β2糖蛋白I）和Eu3＋标记的鼠抗人IgG抗体，建立稳定的高灵敏度的时间分辨荧光免疫（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）法检测人血清中的心磷脂抗体，报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂全自动TRFlA检测仪AutoDELFIA-1235为芬兰Perken公司产品；96孔微孔板、人重组β2糖蛋白I、心磷脂、ACA酶联免疫试剂盒、ACA-IgG抗体标准品为德国AESKU公司产品；鼠抗人IgG二抗由中国医学科学院基础科学研究所提供；Eu3＋标试剂和Eu3＋发光增强液购自EG＆G-Wallac公司；N2-［p－异氰酸－苄基］－二乙烯三胺四乙酸（DTTA）为Sigma公司产品；牛血清白蛋白（BSA）购自卫生部上海生物制品研究所；Sephadex-G25为美国Pharmacia公司产品；浓缩洗涤液、增强液及反应缓冲液由江苏省原子医学研究所提供。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 固相抗原制备 将ACA抗原用50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 9.6缓冲稀释制成包被液，96孔微孔板各孔加100μl，4℃包被过夜。弃去包被液，冲洗3次，每孔加250μl含3g／L BSA的上述缓冲液封闭，室温放置2h。弃去封闭液，拍干后真空抽干，板条密封后置－20℃冷冻保存。

1.3 Eu3＋标记抗体的制备Eu3＋－鼠抗人IgG抗体参照Eu3＋标记盒说明书操作。取鼠抗人IgG抗体l ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol／L NaCl的 50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 8.5缓冲液。收集蛋白峰，浓缩至2g／L。取500μl加入含0.2mg的 Eu3＋-N2-［p－异氰酸-苄基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3＋-DTTA）冻干粉的小瓶中，25℃磁力搅拌反应20h。反应液经用80 mmol／L tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1×40cm）层析，全自动TRFIA检测仪检测，收集蛋白峰，稀释后分装冻干保存。

1.4 ACA－IgG抗体的测定采用二抗间接法，加用稀释液稀释的血清100μl到板条中，25℃反应30min后，洗涤4次，然后加分析缓冲液稀释的Eu3＋-鼠抗人IgG抗体100μl，25℃振荡反应30min后，洗涤6次，再加200μl增强液振荡5min，在AutoDELFIA-1235仪上检测荧光信号。最后从标准曲线计算样品中的ACA-IgG抗体的含量（软件程序机器自带）。

1.5 试剂盒的评价（1）对试剂盒进行剂量－反应曲线的线性进行评价；（2）精密度评价：选低、中、高3份血清样品，同时采用TRFIA法进行批内（n＝20）和批间（n＝8）精密度检测，计算其CV%值；（3）灵敏度：测定20孔零点标准品，x—±2s为其最小测定值，即其灵敏度；（4）特异度：收集50例健康献血者，检测这些患者血清中的ACA-IgG抗体，计算临床特异度；（5）相关性实验：25例阳性血清样品，分别用TRFIA和ELISA 2种方法进行检测，计算其相关系数；（6）稳定性：将试剂盒置于37℃水浴箱7天，再与正常保存的试剂盒做对比。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。2种方法检测结果的一致性检验采用相关性分析，并计算相关系数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Eu3＋标二抗的理化和免疫学鉴定Eu3＋标记鼠抗人抗体经sephadex G-25层析，收集第1洗脱峰，见图1。

2.2 线性范围将一强阳性标本从1∶12.5倍稀释至1∶204800，线性稀释浓度曲线见图2，曲线呈良好线性在稀释浓度1∶50－1∶51200的范围内。

2.3 ACA-IgG抗体-TRFIA的考核数据处理得到ACA-IgG-TRFIA的标准曲线，如图3所示。x轴代表荧光强度，y轴代表ACA-IgG抗体的浓度，结果显示剂量－反应曲线呈良好线性相关。

图1 TRFIA检测sephadex G-25洗脱峰 图2 TRFIA法测ACA可测量范围 图3 ACA-IgG抗体-TRFIA的标准曲线

2.4 精密度评价将低、中、高3份血清样品，同时采用TRFIA法检测，进行批内和批间精密度测试。

表1 批内精密度测试（n＝20）

表2 批间精密度测试（n＝8）

2.5 灵敏度测定20孔零点标准品，x—±2s为其最小测定值，为0.1GPL U／ml。

2.6 相关性实验25例阳性血清样品，分别用TRFIA和ELISA 2种方法所测结果的相关系数为0.987，呈高度相关。

2.7 临床特异度采用自制TRFIA试剂检测50例健康献血者血清中的ACA-IgG抗体，阴性49份，阳性1份，特异度为98%。

2.8 稳定性试验将试剂盒置于37℃水浴箱7天，再与正常保存的试剂盒做对比，结合率仅下降15.8%，其余指标没有明显变化，说明试剂盒稳定性良好，在4℃条件下可保存1年。此外，对于ELISA方法，加入终止液后，随着时间的延长，检测的准确度下降；而对于TRFIA，加入增强液后，板条放至次日而基本不影响荧光结果的检测，由此可见，TRFIA法更稳定。

3 讨论

早期研究人员即发现，ACA ELISA采用牛血清作为封闭液和稀释液时，可以更好地诊断抗磷脂综合征（A ntiphoaphulipids vndrome，APS），进一步研究发现，APS患者的ACA与心磷脂的结合需要血清中一种磷脂结合蛋白－β2糖蛋白I（β2GPI）参与，而牛血清中恰恰含有β2GPI，自身免疫性疾病（如SLE）ACA与包被心磷脂的结合可以因β2GPI的存在而增强，即称其为β2GPI依赖性ACA；相反，梅毒患者血清中的ACA与心磷脂的结合却可被β2GPI抑制，因此又将这些ACA称为非β2GPI依赖性 ACA［5，8，9］。 目 前 认 为 APS 与 β2GPI依 赖性ACA有关，而与非β2GP1依赖性ACA无关。本研究建立的是β2GPI依赖性ACA TRFIA法。

当前，检测ACA多采用ELISA法，ELISA方法存在灵敏度低、线性范围窄、酶标记物不稳定等诸多问题。时间分辨荧光免疫分析技术是近几年快速发展起来的新技术，具有零本底、灵敏度高、重复性好、特异性强、线性范围宽等特点。TRFIA技术标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率，检测精度可达10－18mol／L。激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。每一秒钟检测样品1000次，结果取平均值，有利于提高检测的准确性［10－12］。TRFIA 被 广 泛 用 于 C 反 应 蛋 白［13］、水痘－带状疱疹病毒-IgG抗体［14］、乙型肝炎病毒前S1抗原［12］、抗环瓜氨酸肽段抗体［6］、人巨细胞病毒IgM 抗体［7］等的检测。

在以往ELISA法检测ACA过程中，我们发现有大量ACA弱阳性及临界值的存在，加上准确性和重复性欠佳，给临床诊断这部分患者的自身免疫性状况带来了影响。而本试剂盒灵敏度达到0.1 GPL U／ml，远低于正常参考上限10GPL U／ml，且高、中低三个浓度批内、批间CV均小于10%，从而能够很好地解决这一问题。50例健康献血员血清样本进行ACA的检测，特异性98%，说明本系统不仅灵敏度高，特异性也好。

与国外成熟ELISA试剂相比，2种方法所测结果的相关系数为0.987，呈高度相关，一致性较高，证明其结果可靠。线性范围试验显示，将一强阳性标本从1∶12.5倍稀释至1∶204800荧光计数值从高到低均有明显变化，曲线呈良好线性在稀释浓度1∶50－1∶51200的范围内，具有很宽的量程。将试剂盒置于37℃水浴箱7天，再与正常保存的试剂盒做对比，结合率仅下降15.8%，其余指标没有明显变化，说明试剂盒稳定性良好，在4℃条件下可保存1年。

时间分辨荧光免疫分析仪在国内已较普遍使用，仪器全自动操作，误差减少，操作流程短。铕标记鼠抗人IgG抗体的制备经专业人员培训后可成功标记，储存时间长、无放射性污染。目前，进口或国产的ACA抗体商品试剂盒在2500圆左右，每份标本的检测成本约30圆，而本实验室建立的TRFIA法检测ACA抗体的成本在10圆左右，有价格优势。基于以上几个方面，TRFIA法定量检测ACA抗体的方法有望普遍应用。

总之，利用TRFIA方法定量检测ACA抗体，灵敏度、特异度、精密度高，检测范围宽，试剂盒稳定可靠，对于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病患者的病情，监测治疗效果及预后具有重要意义。

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