pcDNA-GPC3真核表达载体的构建及鉴定

李 莉，李 庆，乔路新，丁 渭，吕福东

（首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparansulfate proteoglycan，HSPG），通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上［1，2］。其开放读码框为1 740bp，编码580个氨基酸的蛋白质前体。由于GPC3在肝细胞癌（HCC）中特异性高表达，而在正常肝或癌旁肝组织中不表达，可以作为肝细胞癌的临床诊断标志物，因此国内外学者对此进行了广泛研究［3－5］。目前认为GPC3可通过激活经典Wnt信号通路促进肝癌细胞的生长［6］，但具体机制仍然不清。本研究通过构建GPC3基因的真核表达载体，为研究GPC3在肝癌中的作用机制提供有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料表达载体pcDNA4.1、E.coliJM109菌株、E.coliDH5α菌株、人类肝脏cDNA文库由本实验室保存，HLE人肝癌细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室赵晓航教授馈赠，兔抗人GPC3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，质粒抽提纯化试剂盒和胶回收试剂盒为北京博迈德科技发展有限公司产品，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，高保真DNA polymerase、DNA分子量标准、T4DNA连接酶、限制性内切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ）、pMD-18simple T vector为 TaKaRa 公司产品，其他生化试剂：溴化乙啶（EB）、氨苄霉素、琼脂糖、乙醇、PBS等均为国产分析纯或进口分装试剂。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 GPC3基因的获得根据GenBank中查找的GPC3开放读码框（1 740bp）自行设计GPC3上、下游引物，并导入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切位点，序列如下：上游5′-CCG GGA TCC ATG GCC GGG ACC GTG CGC-3′（下划线处为 BamHⅠ酶切位点），下游5′-CCG GAA TTC TCA GTG CAC CAG GAA GAA G-3’（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），以人类肝脏cDNA文库为模板进行PCR扩增目的基因，PCR扩增反应条件：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2min，72℃10min。扩增产物长度大小为1 740bp。取5μl反应产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分析。应用DNA片段快速纯化回收试剂盒回收目的片段，与pMD-18simple T vector进行连接，转化入E.coli DH 5α中，进行克隆。经篮白斑筛选，挑取白斑单克隆进行摇菌，并送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

1.3 pcDNA-GPC3真核表达重组质粒的构建与鉴定 将上述T载体产物和真核表达载体pcDNA4.1用BamHⅠ、EcoRⅠ分别酶切，电泳线性片段并予以切胶回收GPC3片段和酶切后的真核表达载体pcDNA并纯化。用T4DNA连接酶连接pcDNA载体片段与GPC3基因片段，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细菌，铺Amp＋LB平板，随机挑取克隆菌落并提取质粒，经酶切鉴定pcDNA-GPC3重组质粒。

1.4 重组质粒再次测序鉴定测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，以确定重组质粒内的目的片段序列正确。

1.5 pcDNA-GPC3转染HLE细胞将消毒、高压后的18nm×18mm的盖玻片置于6孔板中，将处于对数生长期的HLE人肝癌细胞胰酶消化收集，以4×105／孔接种于六孔细胞培养板，每孔加完全培养基10%FBS-MEM 2ml，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至细胞达80%铺满。用LipofectamineTM2000将重组质粒pcDNA-GPC3转入HLE细胞。

1.6 荧光显微镜检测重组质粒pcDNA-GPC3转入HLE细胞48h后，去除培养基，PBS洗涤标本3次，每次2min；4%多聚甲醛溶液固定标本10min；PBS洗涤标本3次，每次2min；1%Triton-100室温孵育20min；PBS洗涤标本3次，每次2min；1%正常羊血清封闭1h，去除多余封闭液；一抗（GPC3抗兔多克隆抗体1∶500稀释）孵育，4℃过夜；PBS洗涤标本3次，每次2min；滴加二抗FITC（1∶500稀释），室温孵育1h；PBS洗涤标本3次，每次2min；用含有DAPI的甘油封片，镜检，拍照；设立阴性对照，以正常兔血清代替一抗，其余步骤相同。

2 结果

2.1 GPC3cDNA的PCR扩增以人类肝脏cDNA文库为模板，用自行设计的引物进行PCR反应，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见一条特异性区带，位于1500－2000bp之间，与预期大小（1 740 bp）相符（图1）。

2.2 T载体和真核表达载体pcDNA-GPC3的酶切鉴定挑取阳性克隆，提取重组质粒。重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，可见1 740bp的插入片段，提示重组质粒含有GPC3基因编码区全长（图2）。

2.3 GPC3在pMD-18simple T vector和在真核表达载体中的序列测定分别采用通用引物正向测序、反向测序及设计引物反向测序，测序结果证明插入片段读框和方向正确。核酸测定结果：目的片段为1 740bp，经与GeneBank中的序列进行比较，与Genbank ID：NG-009286.1的匹配率为99%，DNA序列中发生突变的位点为：1355T→C。DNA所编码的氨基酸序列含有580个氨基酸残基，经比对未发现氨基酸残基的突变。

2.4 荧光显微镜检测结果由图3可见与不表达GPC3的HLE细胞相比，转染pcDNA-GPC3质粒的HLE细胞，可见明显的GPC3的表达。实验组细胞的绿色荧光主要表达于细胞膜上和细胞浆中，而未转染的HLE细胞和阴性对照未见明显的绿色荧光。说明我们成功的构建了可以表达GPC3蛋白的pcDNA-GPC3质粒。

图1 GPC3基因PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳图图2 重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定 图3 转染pcDNA－GPC3质粒与转染pcDNA4.1空载体的HLE细胞对比。可见与转染空质粒的HLE细胞相比，转染pcDNA－GPC3质粒的HLE细胞有明显的GPC3的表达。

3 讨论

自从1997年Hsu等［7］首先报道GPC3mRNA在HCC组织中高表达。随后越来越多的学者发现，在HCC组织中，不管是GPC3mRNA还是蛋白均呈过表达，并在 HCC的早期即已发生［8］。不少学者研究显示GPC3在HCC中具有很高的敏感性和特异性。Shirakawa等［9］用免疫组化的方法检测107例 HCC，GPC3阳性者87例（81.3%）。Llovet等［10］报道，在丙型肝炎后肝硬化背景的早期肝癌组织中（＜2cm的肝癌结节）GPC3表达率100%，其他良性肝病和正常肝组织中表达率为0。Shirakawa等比较了HCC和ICC（肝内胆管癌）组织中GPC3表达情况，发现HCC表达率78.3%，而ICC无表达。并且原发性肝癌患者血清中AFP及GPC3蛋白表达水平之间不具有相关性，因此联合检测AFP及GPC3可以提高原发性肝癌患者诊断的特异性和敏感性，特别是对小原发性肝癌及AFP阴性原发性肝癌患者具有重要的诊断意义。而且研究发现高分化HCC较中分化及低分化HCC的GPC3表达少，GPC3阳性患者的5年生存率较阴性者低，提示其表达水平与原发性肝癌的临床分期、病理分级有关，对预测肿瘤的恶性程度及预后具有重要价值［11］。Ligato等用ELISA法研究腺瘤、局灶性结节性增生、原发性肝癌和转移性肿瘤中GPC3的表达水平，发现GPC3在原发性肝癌的诊断敏感性为83.3%，特异性为96%，而其他类型的肿瘤和增生中均呈阴性，提示GPC3是一个区别原发性肝癌与其它良恶性肝肿瘤和转移灶的高度敏感的肿瘤标志物［12］。现在，GPC3已被广泛用于 HCC的病理鉴别诊断，包括原发性HCC和肝内转移癌的鉴别、高分化HCC与腺瘤及不典型增生的鉴别。

尽管大量研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达极少，但在正常情况下，GPC3对生长起负性调控作用，其表达缺失，导致过度生长及畸形综合征（simpson-golabibehmel syndrome，SGBS）。目前，对GPC3刺激肝癌生长的作用机制不清。存在着通过经典Wnt信号途 径［5，13］、FGF2、IGF2 信 号 途 径［14，15］等 几 种 理论，但具体机制仍然不明。为了更好的研究GPC3在肝癌中发生和发展中的作用机制，本实验构建完成真核表达重组质粒pcDNA-GPC3，所构建的重组质粒经酶切鉴定和序列分析，证实GPC3序列和方向的正确性。将重组质粒转染GPC3不表达的HLE人肝癌细胞后，经荧光显微镜检测，结果表明目的基因已经成功在真核细胞中成功表达，为我们下一步的研究奠定良好的基础。

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