番茄红素对低密度脂蛋白氧化的影响
2012-08-18朋汤义郑书国
朋汤义 郑书国
1.安徽省中医院药剂科,安徽合肥 230031;2. 皖南医学院药理教研室,安徽芜湖 241002
氧化应激是指机体活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生增加或清除减少,从而导致体内氧化还原自稳态失衡,ROS在体内大量蓄积而引起机体氧化损伤的过程。现代研究表明,ROS参与多种疾病的发生发展,其介导的低密度脂蛋白(LDL)氧化修饰是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发生、发展的关键环节[1]。氧化应激学说的提出为应用抗氧化剂防治AS提供了理论依据。番茄红素为天然类胡萝卜素类化合物,主要存在于番茄、西瓜等中,具有较强的抗氧化活性。流行病学研究表明,血清及脂肪组织番茄红素水平与动脉粥样硬化病变程度及心血管疾病发病率呈明显负相关,增加番茄红素摄入可明显降低冠心病发病率[1],提示番茄红素具有抑制动脉粥样硬化作用。本研究主要研究番茄红素在体内外对LDL氧化的影响,以探讨其抗AS的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
新西兰白兔,雄性,体重2.0~2.5 kg,购自江苏省南京金陵种兔场;番茄红素由陕西森弗生物技术有限公司提供;兔Ox-LDL测试盒由大连泛帮生物技术公司提供;其他试剂均为分析纯。752紫外分光光度计,上海第三分析仪器厂;酶联免疫检测仪,Bio-Rad;超速离心机,Beckman公司;高脂饲料,含胆固醇1.2%,猪油4%,普通饲料94.8%。
1.2 方法
1.2.1 LDL氧化易感性测定 取健康人静脉血,EDTA抗凝,分离血浆,超速离心法分离LDL,并于4℃在10 mmol/L PBS(pH=7.4)中透析24 h,Bradford法测定LDL中蛋白质含量,并调整浓度至1 mg/mL。实验设对照组、模型组(LDL+Cu2+)、番茄红素组(LDL+Cu2++番茄红素),每组6个样本。于96孔培养板中加入LDL和PBS(终反应体积0.2 mL,LDL终浓度为100 μg/mL),混匀。番茄红素组分别加入不同浓度番茄红素溶液(终浓度分别为5、10和20 μmol/L),对照组和模型组加入等量PBS,混匀,37℃孵育1 h。除对照组加入PBS外,其余各组均加入CuSO4溶液(终浓度5 μmol/L),37℃孵育3 h,每10分钟测定1次234 nm处吸光度(A234)。以时间为横坐标,A234为纵坐标,绘制LDL氧化曲线,参照文献[3]方法计算LDL氧化延迟时间(Lag time)和达最大氧化速率时间(Tmax)。将上述反应体系继续孵育至12 h,加入EDTA-Na2终止反应,TBA比色法测定反应液中MDA含量。
1.2.2 家兔高脂血症模型建立与给药 新西兰白兔32只,随机分为4组,即正常组、模型组和番茄红素高(20 mg/kg)、低剂量组(10 mg/kg),每组8只。除正常组喂饲普通饲料外,其余各组均给予高脂饲料。番茄红素组每天早晨先给予含药饲料(5 g/kg体重),待吃完后再给予高脂饲料,以保证药物的完全摄入。每只家兔每天进食总量控制为120 g左右,分2次于早晨和晚上投喂,自由饮水,共4 周。4周末家兔血清总胆固醇和LDL水平均较模型组显著升高(P<0.01)。数据略。
1.2.3 家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性测定 分离血清,按试剂盒说明测定Ox-LDL水平。取EDTA(1 mg/mL)抗凝全血, 4℃离心分离血浆。密度梯度超速离心法分离LDL,按1.2.1中方法透析24 h,调整蛋白浓度至1 mg/mL。于96孔培养板中分别加入LDL (1 mg/mL) 20μL、PBS 160 μL(10 mmol/L)及 CuSO4溶液 20 μL(50 μmol/L),使 LDL和 CuSO4终浓度分别为0.1 mg/mL和5 μmol/L,混匀,置于酶联免疫检测仪中37℃孵育,按1.2.1中方法测定A234,绘制氧化曲线并计算LDL氧化的Lag time和Tmax。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 番茄红素对LDL氧化易感性的影响
Lag time和Tmax是衡量LDL氧化易感性的两个重要指标。由表1可见,番茄红素能显著增加铜离子诱导LDL氧化的Lag time和Tmax,这一结果与其抑制MDA生成作用一致,提示番茄红素能有效抑制铜离子诱导的LDL氧化。
表1 番茄红素对铜离子诱导的LDL氧化的影响 (± s,n=6)
表1 番茄红素对铜离子诱导的LDL氧化的影响 (± s,n=6)
注:与对照组比较,bP<0.01; 与模型组比较 ,cP<0.05,dP<0.01
组别 剂量(μmol/L)Lag time(min)Tmax(min)MDA(nmol/mg protein)对照组 - - - 4.36±1.15模型组 - 52.54±19.35 102.85±24.86 18.46±3.55b番茄红素组 5 61.76±17.33 122.50±24.66 12.88±2.71c 10 72.77±18.22c 145.36±29.84c 10.33±3.06c 20 79.58±19.66d 152.70±29.69d 8.74±2.88d
2.2 番茄红素对家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影响
由表2可见,喂饲高脂饲料4周后,家兔血清LDL抗氧化能力明显下降,表现为Lag time和Tmax均明显缩短(P<0.01),同时血清Ox-LDL水平明显升高(P<0.01);补充番茄红素能显著提高LDL氧化的Lag time和Tmax(P<0.05或P <0.01),降低血清Ox-LDL水平(P<0.05或P<0.01),提示番茄红素能明显提高高脂血症家兔LDL抗氧化能力,抑制LDL氧化。
3 讨论
ROS是生物体在需氧代谢或巨噬细胞呼吸爆发中产生的活性基团或分子,具有高度氧化活性,极易攻击生物膜中脂质及核酸、蛋白质等生物大分子,引起机体氧化损伤。现代研究表明,ROS参与多种疾病的病理进程,其中ROS介导的LDL氧化修饰,是AS形成与发展的关键环节[4]。各种AS危险因素如高脂血症、高血压、糖尿病等均可增加ROS产生,引起LDL氧化,促进AS的形成与发展。临床资料显示,AS患者血清及LDL抗氧化能力均较正常人显著降低,血浆Ox-LDL水平明显升高且与AS病变程度密切相关[5]。抗氧化剂如维生素E、维生素C及β胡萝卜素等的摄入量与AS性心血管病发病率呈负相关,补充多酚类、类胡萝卜素类等天然抗氧化剂能明显提高机体及LDL抗氧化能力,降低心血管疾病死亡率[6-7]。这些结果提示,补充抗氧化剂、增强机体及LDL抗氧化能力可能是防治AS及其相关性心脑血管疾病有效途径之一。
表2 番茄红素对家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影响 (± s,n=8)
表2 番茄红素对家兔血清Ox-LDL水平及LDL氧化易感性的影响 (± s,n=8)
注:与对照组比较,bP<0.01; 与模型组比较 ,cP<0.05, dP<0.01
Group Dose(mg/kg)Ox-LDL(μg/L)Lag time(min)Tmax(min)对照组 - 62.50±13.83 72.43±14.65 148.65±25.86模型组 - 126.28±30.68b 45.24±10.20b 103.65±21.48b番茄红素组 20 82.84±19.25d 63.76±16.55d 139.36±25.48d 10 96.20±21.32d 59.54±14.78c 125.40±26.45c
番茄红素为天然类胡萝卜素类化合物,能明显抑制AS的形成与发展[8],但对其抗AS确切机制至今仍未完全阐明。本研究采用反映LDL氧化易感性的两个主要指标Lag time和Tmax[9],观察了番茄红素对LDL氧化的影响。结果显示,番茄红素在体外能明显延长LDL氧化的Lag time和Tmax,提示番茄红素能有效提高LDL抗氧化能力,这一结果与其抑制脂质过氧化产物MDA生成相一致,说明番茄红素能有效抑制LDL氧化。现代研究发现,番茄红素分子中含有长链共轭多烯结构,它能通过物理和化学方法清除体内单线态氧、过氧化自由基等活性氧,从而保护脂质、蛋白质等免受氧化损伤。此外,某些类胡萝卜素类化合物如玉米黄质、β胡萝卜素等还能掺入生物膜或脂蛋白之中,当遇到活性氧攻击时,这些化合物首先被氧化,从而保护生物膜或脂蛋白免受氧化损伤。番茄红素具有类似的结构,且脂溶性较高,因而推测番茄红素也可能通过掺入LDL之中而发挥抗氧化作用,从而抑制LDL氧化。体内研究也发现,番茄红素能明显提高高脂血症家兔LDL抗氧化能力,降低血清Ox-LDL水平,说明番茄红素在体内也能有效抑制LDL氧化。大量研究表明,内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等可通过清除ROS而保护LDL不被氧化,提高这些抗氧化酶活性可明显增强LDL抗氧化能力,抑制AS发生发展[10]。既往研究显示,番茄红素也可诱导活化某些内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px等的活性[11],因此推测番茄红素提高内源性抗氧化酶活性可能是其抑制LDL氧化的机制之一。
综上所述,番茄红素在体内外均能有效抑制LDL氧化,降低高脂血症家兔血清Ox-LDL水平,其机制可能与番茄红素直接清除ROS和提高机体抗氧化酶活性有关,这可能是番茄红素抗AS主要机制之一。
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