Stat3-siRNA表达质粒在AFP阳性肿瘤基因治疗中的应用

鹿理友 于传亭 辛志玲

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有发展迅速，侵袭性强，恶性程度高，预后差等特点[1]。虽然手术技术的提高，治疗有了很大的提高，但发现时往往已至晚期，手术效果不理想。基因表达水平的改变是细胞癌变的一个重要因素。近几年发现和发展起来的RNA干扰技术，是一种新兴基因阻断技术，同源性mRNA的降解通过内外源性双链RNA触发，从而使该基因表达沉默。人体正常组织及细胞中有STATs少许表达，正常的生理功能得以维持。但持续性的激活在肿瘤组织及细胞中却表现出来[2]，被认为是潜在的肿瘤抑制因子。其中以sTAT3尤为活跃，现多认为其可促进肿瘤细胞的凋亡[3]。本研究观察stat3-siRNA表达质粒在治疗AFP阳性肿瘤基因中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI 1640培养基购自Invitro-gen公司;无内毒素质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;转染试剂购自大连宝生物公司;电脉冲仪为德国ECM 630;电击杯购自Bio-Rad生物公司;细胞总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-p01ymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒购自TAKARA公司;人肝癌细胞株HepG2为本室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常规方法接种于1640新鲜培养基复苏的肝癌细胞株 HepG2，于37℃，5%的 CO2培养箱中培养，含10%小牛血清，含均100 U/ml双抗青霉素、链霉素，G418浓度为400ug/ml，传代培养用0.25%的胰蛋白酶消化，观察是否为细胞对数生长期，备实验用。

1.2.2 质粒DNA的扩增与抽提 由上海生物工程技术有限公司合成的长度为350 bpPCR产物，引物序列如下:βactin sense: 5'GCACCACACCTTCTACAATG 3'; antisense:5'GTGGTGAAGCTGTAGC3'。根据美国国立卫生图书馆基因库中人STAT 3 mRNA序列(NM 31500)合成其引物序列如下:mstAT 3 sense:5'CAGccTcTCTGCAGAATTCAA3';antisense:5'AGCCCATGTGATCTGACACC 3'，取 100 μl感受态细胞，待转化的质粒DNA50ng加入，轻轻混匀后30 min冰浴，热休克42℃90 s后，立刻2 min冰浴，LB 培养基900 μl加入，摇床振荡，45 min培养。离心5 min以4℃4000 r/min，大部分上清弃去，仅200 μl培养基留下，菌体轻轻莆悬，在50 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上将其涂布，37℃培养过夜，接种阳性菌落于4ml LB培养基中，37℃振荡过夜。质粒抽提采用美国Qiagen公司小提质粒试剂盒，严格依照说明书步骤提取。

1.2.3 RNA的提取 按试剂说明书完成RT-PCR收获的细胞，取总RNA10 μg逆转录为cDNA以紫外分光光度计法定量后进行，PCR条件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循环，25 μL体系，PCR 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为内参，EB染色，图像分析应用天能Gis凝胶成像系统，以光密度/面积表示PCR产物量，最终结果以STAT3产物量/b-actin产物量的比值，3次实验重复，引物序列:引物均由上海生工公司合成，B-actin:Sense5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'， Antisence5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3';STAT3:Sense5'-TTGCCAGTTGTGGTGATC-3'，Antisence 5'-AGACCCAGAAGGAGCCGC-3'。

1.2.4 Western blot方法检测 收集空白组、阴性对照组、siRNA组细胞。离心制备的单细胞悬液，上清液弃去，PBS冲洗，50 μl预冷的细胞裂解液加入，30 min冰浴中裂解，离心20 min已4℃、12000r/min，取上清，-70℃保存待测。测定蛋白含量应用Bradford比色法。样品电转移到PVDF膜上，在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后。置PVDF膜于5%脱脂奶粉溶液中。4℃封闭过夜。加入兔抗人，浓度为1∶500～1∶1000，1.5～2 h抗孵育。TBST洗膜后加入羊抗兔二抗1∶5000孵育。lh孵育，Lurriglo Keageut试剂A、B液洗膜后加入，反应15～30 min。X光片暴光，拍照。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 培养缓冲液中加入转染后的肝癌细胞，按Immuno-tech公司的说明书进行，用冰PBS液洗2次1×106个/ml细胞，细胞浓度调整为1×106个/ml，于490 μL细胞悬液中加入5 μl Annexin V液(1∶10稀释)和5ul碘化丙锭(250μg/ml，冰浴放置10min，转染48h后的细胞1×106个分别收集，离心，细胞用冷PBS悬浮，离心10min以1000 r/min，清洗2遍，弃上清，用1ml注射器将细胞快速推入700ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上，PBS洗2次，细胞密度调整为1×109/L，用RNase消化后，1.5ml PI50 mg/L加入对DNA进行染色，混匀后单参数分析上流式细胞仪FCM做，各期细胞所占比例根据实验数据用累积曲线分割法计算，实验共重复3次，用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，计量数据均以均数±标准差(±s)表示。多组均数间的显著性检验用方差分析，两组均数间的比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 stat3 mRNA的表达量比较 经比较，stat3相对量在空白组和阴性对照组无明显差异，siRNA组的stat3相对量比空白组和阴性对照组明显减少(P＜0.01)，见表1。

表1 stat3 mRNA的表达量比较

2.2 凋亡率与G1期阻滞率的比较 流式细胞仪结果显示，转染stat3-siRNA的细胞与阴性对照组、空白对照组比较在G1期出现明显阻滞，在 G1期出现的阻滞为(78.17±21.73)%，凋亡率达(21.39±9.47)%，与空白组和阴性对照组比较有明显差异(P＜0.01)，见表2。

表2 凋亡率与G1期阻滞率的比较

3 讨论

世界范围内原发性肝癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，新患此病的患者每年约有100万以上，肝癌发患者数中国居世界首位，每年死于肝癌约23万人，占全球肝癌患者死亡数的53%，列恶性肿瘤病死率第2位，虽有进展的综合性治疗手段，但令人满意的疗效仍不能取得[4]。到目前尚未清楚肝癌的确切发病机制，但可以肯定其形成是一个多因素、多阶段、多步骤、多系统、多基因参与的复杂过程，一些信号转导通路的异常可能涉及到，进而异常的激活一系列原癌基因以及失活导致的抑癌基因突变。

近年来兴起的RNAi技术，分子生物治疗中为异常表达stat3肿瘤开辟了新的途径，与传统的基因治疗方法相比RNAi具有两大明显优势，高特异性和高抑制率，与之序列同源的mRNA能够被siRNA非常特异地诱导降解，而无关基因不受影响;且其表达抑制基因的效率极高，甚至基因表达可完全阻断，效果接近基因敲除技术。siRNA是21-23bp小片段双链RNA，可以和靶基因mRNA序列特异性互补结合，诱导其降解，RNA干扰效应产生强大[5]。近年siRNA成功转入活体内的进展，使得siRNA药物被人们越来越期待能成为精力充沛的“魔术子弹”，应用于病毒感染、寄生虫感染、人类肿瘤等的治疗[6]。siRNA可以特异性地作用于信号转导通路以及肝癌的相关基因，可望提供标记物和治疗靶点为肝癌的诊断和治疗[7]。与蛋白相比，在细胞能耗方面非编码RNA作为调控分子存在优势，因为其不需要翻译，能量消耗更少，而且比蛋白更容易降解[8]。

Stat3是一类脱氧核糖核酸结合蛋白，有少量表达在细胞浆内，其在细胞核内无表达，是转录激活因子家族与信号转导的重要成员之一。Stat3信号传导通路接受多种非受体酪氨酸激酶、G蛋白、细胞因子、生长因子等分子刺激，通过借助细胞内的一类具有激酶结构的连接蛋白JAKs磷酸化而被激活从而完成信息转导。设想癌细胞内stat3基因的表达如能设法阻断，癌细胞增殖能力定会大大减弱，同时减弱凋亡抑制[9]。Gao等[10]设计人喉部鳞状细胞癌Hep2细胞转染两对STAT3-siRNA，研究结果显示在未经处理的Hep2细胞和空质粒对照的Hep2细胞中STAT3被表达，而STAT3的表达在siRNA-sTAT3转染的细胞中明显减少，且表现为时间和剂量依赖性。

RNAi技术可以使特定基因的表达在mRNA水平抑制。而一种简单有效的RNAi实现方法是通过化学合成、细胞内表达siRNA。本研究中，我们成功地合成了siRNA转染肝癌HepG2细胞后。实现了有效抑制STAT3的基因表达，与空白组和阴性对照组均有明显差异(P＜0.01)。充分显示了该技术抑制基因表达特异、高效、简便快捷的优点。应用Western blot证实stat3在人肝癌细胞的过度表达由于siRNA而明显抑制，随着stat3表达抑制，癌细胞出现凋亡，本研究显示siRNA组的凋亡率明显比空白组和阴性对照组增高(P＜0.01)。我们认为，以sTAT3为靶点的siRNA技术有望成为肝癌基因治疗的新途径。

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