食品微生物快速检测技术研究进展

邹小龙，姜川，郝大伟

（丽水市质量技术监督检测院，浙江丽水323000）

食品微生物快速检测技术研究进展

邹小龙，姜川，郝大伟

（丽水市质量技术监督检测院，浙江丽水323000）

快速检测食品中微生物的方法在食品卫生检验方面起着越来越重要的作用，最终将达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。快速方法包括电化学法、细菌直接计数法、免疫学技术、PCR法、全自动微生物分析系统等。对上述各种快速检测食品中微生物的方法作一综述。

快速检测；食品；微生物

Abstract:The rapid detection of microorganisms in food testing methods in food hygiene plays an increasingly important role,will eventually be able to prevent the occurrence of food-borne diseases and food poisoning purposes.Rapid methods include electrochemical method,bacterial direct counting method,immunological techniques,PCR method,fully automated microbial analysis system.In this paper,the above-mentioned rapid detection method of micro-organisms in food are reviewed.

Key words：rapid detection;food;microbial

20世纪90年代末至今，全球食品安全恶性事件频发，食源性疾病已经成为影响公共健康的重要因素。据WHO统计，发达国家每年约有三分之一的人感染食源性疾病，而且在一些发展中国家，食源性疾病往往是致人非正常死亡的主要原因。根据不同的资料来源，全世界每年有220万～1000万人因患食源性疾病而丧生。食源性疾病主要是由微生物和化学药物所引起的，其中微生物引起的食源性疾病占具一半以上的比例。食品中的微生物污染成为食品安全的首要问题。微生物污染存在在食品生产、加工、储存、运输、销售、到食用的整个过程的每个环节中，对人体产生严重的危害。常规的检验大多通过培养基培养目标微生物，然后利用肉眼或放大镜观察计数的方式，来确定食品是否受到此微生物的污染。常规检测手段由于步骤繁杂，判断指标一般都需要肉眼观察，因此检测时间较长，少则2 d～3 d，多至数周，才能确定。这往往无法满足现代化食品工业以及社会发展的食品安全快速检测需求。如何快速、实时、现场的检测食品微生物污染成为目前急需解决的技术问题。

鉴于食品工业对微生物快速检测的需求，微生物快速检测技术得到了迅速的发展。各种基于不同类型的新型快速检测技术相继出现。例如，利用培养基电化学性质变化检测微生物；基于流式细胞仪和固相细胞计数仪的细菌直接计数法；基于抗原抗体免疫学技术的快速检测技术；基于聚合酶链式反应（PCR）的微生物快速检测技术；传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合的集成化商品化快速分析系统等等。本文将对各类微生物快速检测技术进行详细阐述。

1 基于电化学原理的微生物快速检测技术

电化学阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中，会使培养基中的大分子电化学惰性物质，如碳水化合物、蛋白质和脂类等代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性和氧化还原性，使培养基的电化学性质发生变化。通过检测培养基的在电极表面体现的电压、电流、电阻抗等变化情况，即可判定细菌在培养基中的生长、繁殖特性。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体的检测，具有高敏感性、特异性、快速反应性和高度重复性等优点。

国外在此领域的研究工作开展相对较早。1979年T.Matsunaga首次实现了燃料电池型电极系统对培养液中细菌进行了快速测定。此系统由双电极体系构成，每一电极均由铂阳极和Ag2O2阴极复合而成，在参比电极阳极表面覆有纤维素透析膜，用于扣除基体电流对测定的干扰。检测结果显示，工作电极与参比电极电流之差与微生物浓度呈线性关系，响应时间为15 min，检测限为 107cell/mL[1]。1982 年 Nishikawa将上述检测系统加以改进。使用微孔滤膜富集微生物，使用2，6-二氯酚靛酚作为电子传递媒介，增大了响应电流，显著的提高了检测限，达到104cell/mL[2]。1984年T.matsunaga又开创了平面热解石墨电极为工作电极的循环伏安法检测微生物细胞。实现了几种微生物细胞的识别，第一次提出可利用生物传感器进行细胞种类的识别[3]。1988年G.Ramsay等首次利用伏安型细胞传感器进行了菌数浓度的测定。以E.coli为试验菌种，铁氰化钾为电子传递媒介，利用微机化极谱仪控制工作电极（Pt电极）电位在﹢400 mV（vs Ag/AgCl电极)，测量电流对的时间斜率，能够实现对生肉、牛奶、废水中微生物浓度的监测，响应时间小于1 min[4]。

国内在基于电化学技术的微生物快速检测技术研究虽然起步相对较晚，但是发展非常迅速，也取得了不少研究成果。1992年，许春向等利用电化学方法，分别研究了以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）和4，4'-联吡啶为电子传递体的伏安型微生物快速测定传感器。研究表明，以2，6-二氯酚靛酚（DCIP）为电子传递体的微生物细胞传感器可连续监测啤酒发酵罐中酵母菌总数的燃料电池型细胞传感器，响应时间为5 min，电极寿命大于150 d[5]。以一联毗啶为电子传递体的微生物细胞传感器不但能够用于微生物的计数，同时能够用于微生物细胞的识别。研究实现了对啤酒酵母菌、枯草杆菌和大肠杆菌的检测。细胞识别传感器除了可以识别一些微生物细胞、动物及人的淋巴细胞、粒细胞外，尚可识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌[6]。2001年，北京检验检疫局的陈广全等人实现了以改进的沙门氏菌选择培养基四硫磺酸盐煌绿增菌培养基（TTB）为培养基，以电化学阻抗技术为测量手段，通过在培养基中加入氧化三甲氨增加培养基的电阻抗变化灵敏度，连续检测沙门氏菌代谢所引起培养基的电阻抗变化值，利用培养基电阻抗降低的百分比判定沙门氏菌的存在。经与常规培养法进行比较，对加入食品中的21种已知沙门氏菌属的检测，电阻抗法19个为阳性，检出率在90%以上，常规法检出18个，检测结果与常规培养法相一致，对于阴性结果能在48 h内出具结果。结果表明电阻抗法能够快速、可靠地检测食品中的沙门氏菌[7]。2005年，西安电子科技大学的周永军等也实现了以色素还原试验法为基础，通过添加适量的生物催化剂和离子激励剂，实现一种能快速测定奶乳制品中细菌含量的电化学生物传感器，并对牛奶中的杂菌进行了测量。研究结果表明，该生物传感器能有效的测定鲜奶中的微生物含量。它相对于传统活菌落检测方法相比，具有快速、简便、实时检测等优点[8-9]。

2 基于细菌直接计数法的微生物快速检测技术

基于细菌直接技术法的微生物快速检测技术主要包括流式细胞仪（FCM）和固相细胞计数（SPC）法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小，荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量[10]。2000年，澳大利亚麦夸里大学的S.Gunasekera等实现了用流式细胞术快速检测牛奶中的菌落总数，解决了牛奶中蛋白质和脂质颗粒对流式细胞技术中的影响问题，建立了基于清除牛奶中酶的应用流式细胞术快速检测（1 h以内）牛奶中菌落总数的方法。当把细菌添加到经过超热处理的牛奶中时，在流式细胞术检测与传统的平板培养法二者之间具有很好的相关性（r≥0.98）。对于原料奶的检测呈显著相关（P＜0.01），并且二者之间具有很好的相关性（r=0.91）。此方法的检测限为≤104/mL牛奶，满足许多国家和地区的安全标准[11]。目前，流式细胞技术已经建立了细菌总数、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌等的快速检验方法。

固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测[12]。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到ChemScan上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于传统平板计数法[13]。2001年，H.Perry-O'Keefe等应用过滤器肽核酸原位杂交对特殊微生物进行检测、识别和计数。基于膜过滤方法，通过原位杂交来分析小菌落，过氧化物酶标记的PNA探针，靶点为特异的rRNA序列，再利用直观的化学发光反应，使小菌落能够在膜上形成发光的小亮点而被观测到。此方法与传统的平板计数法相比有95%～100%的相似。应用这种方法比常规的培养法检测革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌时间要缩短3倍以上[14]。

3 基于PCR的微生物快速检测技术

聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain-Reaction）是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，数小时后能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。即可将皮克（pg）水平的DNA特异地扩增到能够检测的微克（μg）水平。无须通过繁琐费时的基因克隆程序，便可以获得足够数量的精确的DNA拷贝。微生物快速检测中，可以利用PCR技术将特异性DNA片段进行扩增识别目标细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间。

2007年，美国疾病与预防控制中心的F.C.Tenover利用PCR技术实现了耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐多药结核分枝杆菌等常规难以快速检测的多种菌的快速检测。基于分子生物学的检测技术能够在约1 h从鼻孔中检测出耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌，约4 h从直肠样本中分离出肠球菌的耐万古霉素A和B基因。新型焦磷酸实验可以在一天之内从分枝杆菌阳性株肉汤培养基上直接得到耐多药结核分枝杆菌的结果。这些数据对医生在治疗以及感染控制方面都有所帮助[15]。当然，PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响等等。

4 基于免疫学的微生物快速检测技术

免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成[16]。胶体免疫层析法能快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌，应用胶体金免疫层析法检测食品中的沙门菌，简便快速，无需特殊仪器设备，适合现场检测之用。

2005年，M.N.Widjojoatmodjo等实现了应用磁免疫技术，再结合PCR方法快速检测沙门氏菌。他们使用涂有沙门氏菌单克隆抗体的磁性粒子从样品中提取细菌，结果获得了一些细胞溶解的，包含细菌DNA的浮在表面的，来自鼠伤寒沙门氏菌中的引物，DNA复制起点163 bp的区域。引物的特异性被设定在PCR中，所有25个沙门氏菌属的菌株都用来进行试验，但不包括肠杆菌科的其他19个属的菌种。100 CF敏感度的鼠伤寒沙门氏菌通过琼脂糖凝胶电泳染色得到的增强的样品。放大的产物通过Southern杂交得到了10倍于初始的敏感度。107cfu的大肠杆菌检测水平没有任何干扰。因此磁免疫PCR方法能在5 h之内，对于快速检测医学样品和食品中的沙门氏菌更加有效[17]。

5 集成化商品微生物快速分析系统

微生物快速检测除了在研究层面上不断创新与深入，同时商品化实用型仪器也不断涌现，例如法国梅里埃VITEK系列全自动微生物分析系统、美国的mini-VIDAS荧光酶标分析仪、意大利的ATB微生物分析系统以及美国的Bactometer全自动微生物检测计数仪等等。此类实用型微生物分析仪一般都由传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合，运用概率最大近似值模型进行自动微生物检测，可鉴定由环境、原料及产品中分离的微生物。一般仅需4 h～18 h即可报告结果，以常规法鉴定细菌，只能得到是或不是某种菌，要想知到是哪种菌还要做大量、烦琐的生化试验，而集成化商品化分析仪一般在短时间内即可直接报告是什么菌。法国生物梅里埃集团公司出品的Vitek-AMS自动微生物检测系统属当今世界上最为先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。Vitek对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的Vitek试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种，可鉴定405种细菌[18]。用AMS明显缩短肠道菌生化鉴定的时间，如鉴定沙门菌属只需4 h，鉴定志贺氏菌属只需6 h，鉴定霍乱弧菌等致病性弧菌亦只需4 h～13 h。总之，随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，传统的微生物检测技术将逐渐被各种新型简便的微生物快速诊断技术所取代。近年来兴起的基因探针技术及全自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，具有非常广阔的应用前景。

6 总结与展望

微生物检测技术研究与开发一直是食品质量安全研究的重点、热点方向之一。传统的微生物检测方法虽然消耗的时间长，效率低，但是它仍然广泛的应用于微生物的检测，并作为官方检测标准长期应用于企业以及相关检测部门。但是，随着工业化的快速发展以及现代物流技术的进步，对微生物快速检测的需求越来越大，极大的促进了各种微生物快速检测技术的研究与开发。以上介绍的几种快速检测技术得到了很好的发展，并且某些已经应用于实际工作当中。但是，总体来说，大部分微生物快速检测技术还只停留在科学研究阶段，对微生物识别的分辨率和计数的灵敏度还远达不到实际的要求，例如食品卫生检测标准中大多数食物的菌落总数指标限量标准都在103个/mL～105个/mL，有的甚至更低。微生物快速检测技术在识别分辨率及计数灵敏度方面还需要进一步的改进和完善。总之，随着微生物快速检测技术的发展，将会有更多的快速检测技术得到实际应用，并替代传统分析方法，服务于各类检测部门。

[1]Matsunaga T,Karube I,Suzuki S.Electrode System for the Determination of Microbial Populations[J].Applied and environmental microbiology,1979,37(1)：117-121

[2]Nishikawa S,Sakai S,Karube I,et al.Dye-Coupled Electrode System for the Rapid Determination of Cell Populations in Polluted Water[J].Applied and environmental microbiology,1982,43(4)：814-818[3]Matsunaga T,Namba Y.Selective determination of microbial cells by graphite electrode modified with adsorbed 4,4′-bipyridine[J].Analytica Chimica Acta,2002,159：87-94

[4]Ramsay G,Turner A P F.Development of an electrochemical method for the rapid determination of microbial concentration and evidence for the reaction mechanism[J].Analytica chimica acta,1988,215(1/2)：61-69

[5]李刚,许春向,马延海.连续监测啤酒发酵罐中酵母菌总数的菌数电极系统[J].传感器技术学报,1992,6(2)：26-30

[6]谢平会,许春向.识别和计数微生物细胞的伏安型生物传感器的研究[J].传感器技术学报,1995,9(3)：24-29

[7]陈广全,张惠媛,饶红,等.电阻搅祛检测食品中沙门氏茵[J].食品科学,2001,22(9)：66-70

[8]卢智远,牛中奇,刘启,等.一种微生物检测的生物电化学方法研究[J].传感器技术学报,2005,18(3)：481-487

[9]周永军,卢智远,牛中奇,等.环境污染菌快速检测生物电化学方法研究[J].生物医学工程学杂志,2007,24(6)：1237-1240

[10]S G T,A V D,V A P.Potential for broad app lications of flow cytometryandfluorescencetechniquesinmicrobiologicalandsomatic cell analyses of milk[J].Food microbiology,2003,85(3)：269-279

[11]Gunasekera T S,Attfield P V,A D.A Flow Cytometry Method for Rapid Detection and Enumeration of Total Bacteria in Milk[J].Applied and environmental microbiology,2000(3)：1228-1232

[12]T L J,A H M,R W A.Comparison of fluorescence microscopy and solid-phase cytometry methods for counting bacteria in water[J].Applied and environmental microbiology,2004,70(9)：5343-5348

[13]王晓英.固相细胞计数法一种快速检测单细胞细菌的食品微生物新检测方法[J].国外医学卫生学分册,2003,30(3)：183-186

[14]H.P-O K,H.S,A.B,et al.Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection,identification and enumeration of specific microorganisms[J].Journal of applied microbiology,2001,90(2)：180-189

[15]TenoverFC.RapidDetectionandIdentificationofBacterialPathogens Using Novel Molecular Technologies：Infection Control and Beyond[J].Clinical infectious diseases,2007,44(1)：418-423

[16]M V,A P,B L.Meta-analysis of food safety information based on a combination of a relational data-base and a predictive modeling tool[J].Risk Anal,2005,25(1)：75-83

[17]N W M,Fluit A C,Torensma R,et al.Evaluation of the magnetic immuno PCR assay for rapid detection of Salmonella[J].Eur J Clin.Microbiol Infect Dis,1991(10)：935-938

[18]杨毓环,陈伟伟.VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用[J].海峡预防医学杂志,2000,6(3)：38-39

Rapid Detection Food Microbiology Research Progress

ZOU Xiao-long,JIANG Chuan,HAO Da-wei
(Lishui Testing Institute of Quality Technical Supervision,Lishui 323000,Zhejiang,China)

2011-12-15

浙江省质量技术监督局一般项目（20070245）

邹小龙（1965—），男（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品微生物快速检测。