食品中3种致病菌快速检测方法的研究进展

夏慧丽

（台州市质量技术监督检测研究院，浙江 台州 318000）

食品中3种致病菌快速检测方法的研究进展

夏慧丽

（台州市质量技术监督检测研究院，浙江 台州 318000）

总结食品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌3种致病菌的快速检测方法。传统的细菌学检测耗时繁琐，不能满足当今发展的需求。目前采用的PCR、ELISA、核酸杂交、生物传感器等分子生物学和免疫学等技术，检测周期短、精确度高、特异性和敏感性好等，这些方法联用能达到更好的检测效果。

沙门氏菌；副溶血性弧菌；单核细胞增生李斯特菌；快速检测

随着国民经济的发展，食品、海产品中存在的卫生隐患问题也愈发严重。沙门氏菌（Salmonellatypli，ST）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是常见的重要食源性致病菌，它们广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖区域，寄生在海洋生物体中[1]，通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒，严重危害人体健康。在我国现行国家卫生标准中，这3种菌被列为致病菌的常规检验项目。

目前我国食品中致病菌的检验普遍采用传统的细菌学检验方法（如细菌分离培养等）和血清学方法，这些方法一般都繁琐、费时，大致需要4 d～6 d才能出检验结果，且检验的准确度不高。因此，建立一些快速、准确度高的检验食品中致病菌的方法已成为我国食品监管部门的当务之急。本文总结了目前一些检测食品中沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌的快速方法，以期使食品检验工作者了解和掌握更多的食源性致病菌的先进检测技术、加快检测工作的进行。

1 副溶血性弧菌（VP）快速检测方法

副溶血性弧菌是一种革兰阴性嗜盐的多形态细菌，广泛分布于近海岸的海水、海底泥沙、浮游生物和鱼、虾、贝类等海产品中，是引起急性胃肠炎的重要病原菌之一[2]。

1.1 KP溶血实验

副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐热直接溶血毒素（TDH），并能在莪萋氏血平板上产生一种特殊的溶血现象,即神奈川现象。该实验在经过前增菌、选择性增菌、选择性培养后，挑取可疑菌落接种到莪萋氏血平板上，置于37℃孵箱过夜，如菌苔周围出现透明溶血环，即为KP阳性，表明样本中含有VP。该试验是检测副溶血性弧菌最基本的方法,能把绝大部分副溶血性弧菌检测出来，但操作繁琐、所需时间长（约4 d），而且存在部分TDH-株，易漏检[3]。

1.2 免疫学方法

免疫学方法中现在最广泛应用的是酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）。该方法从抗体的包被到酶联显色，都已经具备了成熟的技术，易于制备试剂盒，操作简单，特异性好，灵敏度高。但此反应只能大概区分不同地区和来源的菌株,而且由于抗原位点受环境等因素的影响易发生突变,出现新的血清型时,以现有的血清检测就会漏检。臧红梅等[4]采用斑点酶联免疫吸附实验（Dot－ELISA）技术检测副溶血弧菌，根据棋盘试验确定副溶血弧菌，以出现明显清晰斑点者判定为阳性。

1.3 核酸杂交

免疫学方法是在蛋白水平检测VP，而核酸杂交则是在基因水平进行检测，结果更为特异、准确、可靠。用于检测VP的核酸杂交方法主要有斑点杂交[5]、Southern杂交[6]、夹心法杂交[7]。洪帮兴等[8]利用带正电荷尼龙膜为芯片载体,合成寡核苷酸探针,点样于载体制成寡核苷酸芯片,对食源性感染常见致病菌23SrDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。VP等10种（属）菌杂交结果显示出很好的灵敏度和特异性，检出水平可达10 cfu/mL。

1.4 聚合酶链式反应（PCR）

近年来,随着微生物基因组学的发展,微生物基因检测迎来了新的机遇。根据VP的特异基因序列,设计引物，进行PCR检测，是现阶段检测VP的最快速准确的方法。目前PCR方法主要有任意引物PCR（Ap－PCR）、针对任意引物 PCR、多重 PCR（multiplex－PCR）、实时荧光定量 PCR（real－time PCR）。如 Venkateswaran 等[9]选择gyrB基因设计引物对VP进行PCR，Cordova等[10]选择pR72H基因设计引物进行PCR，特异性、灵敏度都很好。与其他常规生化方法相比，多重PCR更快速，仅8 h就能完成检测，结果更为准确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对标本中靶序列进行定量。实时PCR操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，而且可以进行临床大规模快速检测。

1.5 琼脂糖和纳米金材料检测

琼脂糖和纳米金材料检测是近两年流行的一种初步用于副溶血性弧菌的快速筛检技术，其技术关键是制备免疫电极。赵广英等[11]将HRP-anti-VP掺杂于琼脂糖和纳米金中并修饰于丝网印刷电极表面，从而制备副溶血性弧菌免疫电极，采用循环伏安法表征免疫电极和监测酶促反应，根据还原电流的变化来定量测定副溶血性弧菌。在优化的实验条件下，免疫电极线性检测范围为105cfu/mL～109cfu/mL，检出限为7.4×104cfu/mL（S/N=3）。

2 单核细胞增生李斯特菌（LM）快速检测方法

单核细胞增生李斯特菌（LM）是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为20世纪90年代食品中的四大病原菌之一。过去对食品中LM进行检测时，克隆培养的标准方法需要3周～4周的时间才能得出结果。现在采用的方法为常温培养法，但仍需7 d～11 d才能分离鉴定出来。传统的分离培养鉴定方法人力物力花费很大，已不能满足现实需要。自1985年以来，免疫分析、分子生物学技术用于此菌的检验，大大缩短了检测时间，提高了灵敏度。现就相关的检测技术作一简单介绍，为深入研究提供参考。

2.1 免疫学方法ELISA

1992年Bhunia等[12]利用淋巴细胞杂交瘤技术建立的夹心ELISA方法，能于20h～24h内检测出8cfu/g～10 cfu/g（mL）的样品。现在已有单增李斯特菌检测试剂盒可供使用，用ELISA方法操作较简单，特异性强，反应灵敏度高，但单克隆抗体制备昂贵，检测费用较高[13]。

2.2 聚合酶链反应（PCR）

杨百亮等[14]通过条件优化，建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒，并在同年用PCR对市售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌的检测[15]。姜永强[16]人工感染牛奶经过24 h的培养后PCR检测，可达到600 cfu/mL～6000 cfu/mL牛奶的敏感度。

荧光定量PCR是近年发展起来的一项新技术。荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染，不能定量，探针杂交灵敏度不高，分离洗脱条件不易控制等不足，在疾病的基因诊断中有着广阔的应用前景[17]。金大智等[18]运用实时荧光PCR（Realtime PCR）技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性。

2.3 基因探针

Volokhov等[19]以李斯特的6种毒力蛋白基因为靶基因设计多重PCR，研制出了基因芯片检测单增李斯特菌。核酸探针技术，虽较常规方法具有更多的优点，但还存在着诸如同位素标记探针的放射性污染、检测步骤复杂，耗时长等不足，并且缺乏环境监测和流行病学调查所必需的敏感性。

2.4 胶体金试纸快速检测

崔焕忠[20]制备单增李斯特菌（LM）特异性单克隆抗体，研制胶体金试纸，快速检测食品中LM。对LM纯培养物检测的灵敏度为3.9×105cfu/mL；4℃保质期在120 d以上；对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9×105cfu/mL。该试纸具有快速、敏感、特异的优点，可用于食品中LM的快速检测。

3 沙门氏菌（ST）快速检测方法

在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位，我国细菌性食物中毒中70%～80%是由它引起的。传统的检验方法是采集粪便和血液标本做细菌培养，然后做生化和血清学鉴定，检验程序复杂繁琐、耗时费力，难以应对突发事件的发生。因此，建立一种快速而准确的方法一直是沙门氏菌检测研究的核心问题。为了寻求快速、准确、简便、微量的检测方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法。

3.1 免疫学方法

3.1.1 酶联免疫吸附法（ELLISA）

ELLISA法是将细菌经离心之后，转移到醋酸纤维薄膜上，然后放在多孔板中固定，加抗鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛抗体作用，再加第二酶标抗体作尉，最后以底物显色，产棕色或兰色为阳性。这种方法最小检出量可达104cfu/mL～105cfu/mL，其缺点是会引起假阳性反应。

许多学者把其他方法与免疫学方法结合起来以提高检测灵敏性，大大缩短了样品检测周期[21]。如酶联免疫吸附法与聚合酶链式反应结合，用直接ELISA筛检优先去除假阴性样品，再采用PCR法检测提高检测速度。如黄金琳等[22]直接ELISA法的敏感性和特异性达100%和97.2%，PCR法的敏感性和特异性均为100%。

3.1.2 免疫荧光标记

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。Cloak等[23]利用表面吸附将检测样品吸附于玻璃载片表面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。该方法检测限为103cfu/mL个沙门氏菌，且不呈现假阴性与假阳性反应。

3.2 聚合酶链式反应

作为分子生物学方法，PCR法具有快速、简便、灵敏的特点，是检测沙门氏菌的发展方向。由于PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；各种实验条件控制不当，很容易导致产物突变；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。

3.2.1 常规PCR

刘胜贵等[24]根据自行设计的引物，得到扩增产物是沙门氏菌phoP基因的662 bp的DNA片段。邵碧英等[25]利用沙门氏菌的多个靶基因 invA、hilA、hut、hns建立多重PCR检测，提高了其检出率并同时鉴定其血清型及突变等，降低了检测时间。

3.2.2 RT-PCR（Real-Time PCR）

沙门氏菌实时定量PCR检测技术保留了常规PCR检测的特异性和敏感性，可同步完成多个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的检测处理，极大地提高了检测效率。Burkhard等[26]以肠炎沙门氏菌特异性invA基因序列为模板，通过RT-PCR检测样品，均为阳性。

3.2.3 荧光定量PCR

荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术，可以实现一管多检，同时检测几个项目。钟伟军等[27]建立的荧光定量PCR方法对多种细菌进行检测，所有沙门氏菌的检测结果均为阳性，其它非沙门氏菌的检测结果为阴性。

3.3 快速荧光法检测

选用带有荧光信号的物质作为指示物，此方法操作方便，敏感性和特异性好，如用4-甲基伞形酮辛脂（4－Methyl-umbelliferyl-caprylate，MUCAP）试剂作为荧光信号检测。褚天新等[28]在未知标本的检测中发现MUCAP试验沙门氏菌阳性检出率为常规法的96.07%，相比传统方法，可节约鉴定时间12 h～24 h，是一种高灵敏度和特异性的沙门氏菌快速筛检方法。

3.4 核酸探针

核酸探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术，但其在实际应用中仍存在不少问题。放射性同位素标记的核酸探针具有半衰期短、对人体有危害等缺点，作为常规诊断，特别是在食品检验实验室很不适用。核酸探针技术在检测食品中其他致病菌及产毒素菌等方面也有广泛的应用[29]。

3.5 SPR生物传感器的应用

根据SPR生物传感器实时检测和高灵敏度的特点与沙门氏菌抗体的免疫吸附反应相结合，实现病原菌的快速检测。Bergwerff等[30]使用SPR生物传感器的检测限为107cfu/mL，有100%的特异性，但是SPR生物传感器在国内应用还是很少，有待进一步的研究。

4 小结

沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的分离培养方法对于需要检测大量样本的食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担，快速检测方法除带来检验工作本身的革新外，更重要的是由此而产生的社会效益，如减少食品库存费用、污染等问题得以尽快处理。

目前3种菌的快速检测研究主要集中在PCR、核酸杂交、免疫荧光、酶联免疫ELISA等方法上，但单纯每一种方法均存在很多缺点。如酶联免疫吸附法能避免假阴性，但灵敏度和特异性又不及PCR；常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高。相比之下，RT-PCR不仅克服了PCR的缺点，而且具有操作简单、结果直观、可靠、特异性强、灵敏度高；探针实验存在基因污染等弊端。因此，要使快速检验技术广泛应用，扩大其检验适用范围，克服假阳性和假阴性反应，考虑生产实际应用的可能性和潜在的公共卫生等问题，实现相互间的联用技术是十分必要的。

应该指出的是，快速检测方法的应用并不意味着完全抛弃分离培养方法。在某些情况下，特别是涉及一些需要最终结果的样品时，分离培养方法还是必不可少的。

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Advance in Rapid Detection Study on Three Pathogenic Bacterias in Food

XIA Hui-li
（Research Institute of Quality&Technical Supervision and Inspection,Taizhou 318000,Zhejiang,China）

The development of method for the rapid detection of salmonella typli,vibrio parahae molyticus and listeria monocy to genes in food were reviewed in this paper.The traditional bacteriology detections have not been satisfied the requirement of development because of time-consuming.The current rapid detections,such as PCR,ELISA,nucleic acids hybrid,biosensor and immunology technology,were efficient,precise,highly specificity and sensitivity.At last we prospected the direction of development and perspective of the methods for detection of the three pathogenic bacteria in the future.

salmonella typli;vibrio parahae molyticus;listeria monocytogenes;rapid detection

浙江省质监系统科研计划项目（20090237）

夏慧丽（1978—），女（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品检测与分析。

2011-12-11