真菌毒素检测技术研究进展

尚艳娥

(国家粮油质量监督检验中心，北京 100162)

真菌毒素检测技术研究进展

尚艳娥

(国家粮油质量监督检验中心，北京 100162)

对较为经典的真菌毒素检测技术进行了综述，并对近些年研究开发的一些新技术和新动态作了简要介绍，总结了真菌毒素检测领域的发展趋势和方向，为食品安全检测技术的研究开发提供一定的参考．

真菌毒素;快速检测;多组分检测

真菌毒素是真菌的二次性代谢产物，与真菌本身的生长发育无关，并不是所有代谢物都有毒．一种真菌可能产生多种毒素，多种真菌可能产生同一种毒素［1］．危害较大的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素和麦角类生物碱等［2］．黄曲霉毒素是天然物中致癌性最强的毒素，也是世界各地的农产品及食品最易受其污染的一种真菌毒素，联合国粮农组织估计全世界谷物供应的25%受真菌毒素污染［3］．这些真菌毒素会通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物所提供的动物性食品进入我们的食物链，从而对人畜表现出致癌性、遗传毒性、致畸性．作为一级预防的主要措施，就是制定真菌毒素的限量标准，因此，准确检测真菌毒素含量的技术手段变得极为重要．

1 真菌毒素常规检测技术

真菌毒素的检测方法有很多种，比较经典且已经形成国家标准或行业标准予以实施的检测方法，主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等，这些常规的检测方法主要是针对某一种真菌毒素进行检测．

1.1 薄层层析法

薄层层析法是在20世纪60年代发展起来的一种平面色谱技术，该方法针对不同的样品，用适当的有机溶剂把待检测的毒素从样品中提取出来，经纯化后在薄层板上展开层析、分离，利用真菌毒素的荧光特性，与标准品比较进行定性和定量．国家标准《食品中黄曲霉毒素B1的测定》GB/T 5009.22—2003和《食品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的测定》GB/T 5009.23—2006将薄层色谱法作为第一法实施．

该法的优点是经济，对设备和检验人员要求不高．特别是随着高效薄层色谱法以及薄层扫描仪的发展和应用，提高了薄层层析法的分离效率和检测精确度，由此拓宽了薄层层析法技术在检测真菌毒素领域中的应用，因此该法目前仍是除北美和欧洲以外其他国家，尤其是发展中国家检测食品和饲料中真菌毒素，特别是检测某些本身能够发荧光的毒素的主要检测方法［4］．

1.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是目前已经比较成熟的免疫学方法，文献［5］报道，建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术．该法建立于抗原抗体高度特异性结合以及抗原或抗体的酶标记基础之上，具有灵敏、操作简便、样品前处理无需净化(或只需最小限度的净化)、样品处理量大的优点．但酶联免疫吸附法还存在一定的缺点，主要是由于该法需要的抗体抗原制备过程复杂，技术难度高。此外，方法的特异性强，只能针对单一毒素的检测．因此在改进样品的纯化步骤，提高回收率和灵敏度，减少本底干扰，提高重现性和稳定性，简化分析程序，降低分析成本等方面都有待于进一步发展［6］．

目前已建立多种分析各类农产品和食品中真菌毒素的酶联免疫吸附法，国家标准《食品中黄曲霉毒素B1的测定》GB/T 5009.22—2003将该法定为第二法．国际上检测粮油食品中多种真菌毒素商品化的酶联免疫吸附法试剂盒已被广泛用于实际工作中．

1.3 免疫亲和层析净化荧光光度法

免疫亲和柱净化法因其快速、准确的特性，已经越来越引起人们的重视．免疫亲和柱就是利用真菌毒素特异性抗体制成的一种净化柱，保证真菌毒素与样品基质的有效分离，降低检测方法的检出限，缩短检测时间，减少溶剂用量［7］．目前我国已建立黄曲霉毒素(GB/T 18979—2003第二法)、赭曲霉毒素A(GB/T 25220—2010第二法)、伏马毒素(GB/T 25228—2010第二法)等免疫亲和柱净化荧光光度法国家标准．

免疫亲和层析净化荧光光度法最大优点在于，利用免疫亲和层析柱从粗提液中经一次简单处理便可得到所需高纯度活性物质，不使用标准物质，直接测定样液荧光强度比较定量，大大减少了对操作人员和环境的危害，很好地解决了真菌毒素分析检测中样品不纯问题．该样品前处理技术配合HPLC和荧光光度计，在真菌毒素分析检测中得到广泛应用，但其主要缺点是免疫亲和层析柱价格较高，目前还只有几种真菌毒素有商用免疫亲和层析柱，有的样品上柱前还需先净化，有时还存在回收率较低问题．

1.4 高效液相色谱法

高效液相色谱法是定量分析真菌毒素最常用的方法，可实现对毒素定性、定量、确证同时进行，其中应用最广的是反相液相色谱．由于真菌毒素性质不同，加上分析条件之间相互影响、相互制约，为达到理想的分离效果，分析时要综合考虑流动相、色谱柱、柱温和检测器等分析条件，找出最佳配比．某些自身产生荧光的真菌毒素如OTA和麦角碱可直接用配有荧光检测器的HPLC分析，而其他一些分子中不含发色基团(如伏马毒素)或本身可产生荧光但强度较弱(如AFB和AFG)的毒素进行HPLC分析时需经柱前或柱后衍生、改变流动相条件(如使用离子对试剂、改变流动相pH等)以增强荧光信号方能定量检测［4］．目前我国已建立黄曲霉毒素(GB/T 18979—2003第一法)、赭曲霉毒素A(GB/T 25220—2010第一法)、伏马毒素(GB/T 25228—2010第一法)等免疫亲和柱净化高效液相色谱法国家标准．

除了这些在国内外广泛采用的标准化检测方法，随着科学技术的不断发展，围绕这些经典方法的改进也取得了很大进展．如高效薄层色谱采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性;高效薄层色谱还可与其他分离检测分析技术联用，更有利于化合物的定性鉴别和定量检测，如薄层色谱-傅立叶变换红外光谱联用检测、薄层色谱-拉曼光谱联用检测、薄层色谱-质谱联用等［8］;对于单端孢霉烯族化合物而言，气相色谱法是检测它们的较好方法，因为它们容易基于羟基的衍生来大大增加其挥发性和灵敏度．如在AOAC Official Method 986.18中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法使用的就是气相色谱法［9］．

2 真菌毒素快速筛选检测技术

从目前食品安全发展趋势来看，准确、省时、省力和省成本的快速检测技术，是政府管理部门、食品生产经营企业、销售企业等各方面都迫切需要的控制手段，也是制约食品安全监管的一个瓶颈．因此，建立简便、高效、低成本的现场快速筛选检测方法是食品安全领域的一项急迫而重要的研究内容．近年来，真菌毒素现场快速筛选检测技术取得的进展主要在免疫胶体金层析技术和近红外无损伤检测技术的应用这两个方面．

2.1 免疫胶体金层析技术

胶体金用于免疫学检测研究是20世纪80年代发展起来的一种新型的免疫标记技术，该技术以胶体金作为示踪标记物应用于特异性抗原抗体反应．免疫胶体金层析快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用．该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在醋酸纤维素膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果．而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的［10］．

该项技术应用于食品安全领域的检测才刚刚起步．2005年，赖卫华等［11］利用抗原抗体特异性结合的原理研制了免疫胶体金技术检测赭曲霉毒素A的试纸条;2006年，孙秀兰等［12］研究了黄曲霉毒素B1金标记免疫检测体系建立过程中的影响因素;2007年，邓省亮等［13］利用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测食品中黄曲霉毒素B1的方法．这些试纸条整个过程只需一步加样，一般15 min内就能判定结果，非常适合于大批量样品的现场快速检测，容易被基层掌握并大面积推广，适应我国经济技术发展状况．

2.2 近红外检测技术

近红外(near infrared，NIR)光是指波长介于可见光与中红外区之间的电磁波，波长范围是700～2 500 nm．自20世纪50年代起，随着商品化仪器的出现及近红外光谱和多元线性回归分析应用于测定谷物中水分、蛋白质、脂肪的成功，近红外检测技术在农副产品分析中得到广泛应用，大大推动了近红外技术的应用．近红外光谱以其分析速度快、效率高、成本低、样品预处理简单、测试重现性好、便于实现在线分析、典型的无损分析技术等特点已广泛应用于各个领域．特别是在欧、美及日本等发达国家，很多近红外光谱分析法被列为标准方法［14］．我国也制定了稻谷、小麦、玉米中水分、粗蛋白质、脂肪等含量的近红外测定系列方法(GB/T 24896—2010至GB/T 24902—2010)．

在真菌毒素检测方面，Dowell等用近红外分析了发霉小麦中的呕吐毒素，结果表明呕吐毒素能很好地被近红外测量和预测;Berardo等发现近红外技术可以较好地检测发霉玉米籽粒中的伏马毒素;文献［14］报道，应用近红外检测技术建立模型分析高羊茅中由内生真菌产生的有毒物质麦角生物碱的含量，有效提高了麦角生物碱检测速度．

3 真菌毒素多组分协同检测技术

现有的传统真菌毒素检测方法大多是针对某一种毒素的检测，检测效率低，而且成本普遍较高，因此，发展能同时检测多种毒素的检测方法是未来的发展方向．

3.1 酶联免疫吸附法

近几年，很多研究人员将研究目标放在多组分检测的酶联免疫吸附法上．文献［15］报道，Goryacheva等建立了一种串联式酶联免疫测定法同时检测香辛料中的AFB1和 OTA，可同时对AFBl和 OTA定性分析;Ghali等对突尼斯人2004—2005年间消费的209份不同食物，用竞争性酶联免疫方法分析AFT、OTA和ZEA的含量;Saha等用酶联免疫法同时测定红辣椒中的AFB1和OTA，满足真菌毒素快速测定的需要;Saeger等建立了谷物中OTA和T-2同时检测酶联免疫吸附法，检测结果分别用HPLC和GC-MS验证，OTA假阳性和假阴性分别为2%和4%，T-2假阳性和假阴性分别为6%和3%．酶联免疫吸附法用于真菌毒素检测，由于存在交叉反应而易造成假阳性，使复杂样品受干扰，因此需要用其他方法来验证．

3.2 色谱-质谱联用检测法

色谱质谱联用检测提高样品通量，减少溶剂的损耗，是一种高效能、高选择性、高灵敏度的分离分析方法，结合了色谱、质谱两者的优点，使样品的分离、定性及定量成为连续的过程，其在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛．目前应用广泛的色谱质谱联用方法主要有高效液相色谱一三重四级杆串联质谱法、高效液相色谱一离子阱质谱法、高效液相色谱一四级杆一飞行时间串联质谱法等．无论是哪种色谱质谱联用法，前提是必须把样品净化干净，有效地去除杂质干扰，所以样品的净化处理至关重要［16］．

3.3 生物传感器

生物传感器(biosensors)是一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高科技产品，在食品检测中已经得到重视，随着表面等离子体共振技术被应用于生物传感器，不但降低了检测成本，而且商品化的等离子体共振设备便于携带，可以在野外条件下工作．利用等离子体共振生物传感器检测生物样品时，首先在传感芯片表面固定一层生物分子识别膜，在反应池中放入未知浓度的样品和一定浓度的抗体．液相中的待检物质首先与抗体结合，阻滞了传感器表面的物质与抗体结合，导致金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被等离子体共振生物传感器检测出来，通过绘制标准曲线就能测出样品中待检物质的含量．文献［16］报道，利用该技术同时检测了 AFBl、ZEN、OTA、FBl和 DON 5 种毒素，从样品提取到检测完成(包括膜的再生)总共只需25 min．

3.4 时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析是超微量检测中一项新兴的检测技术，是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高灵敏度相结合而建立的一种微量物质检测技术．时间分辨荧光免疫分析法的原理相似于常用的免疫分析技术，只是采用了一种特殊的标记物，即三价稀土离子(Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+等)代替同位素、酶标记蛋白或荧光物质等．当抗原抗体发生特异性结合后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的．该技术由于采用了三价原子标记技术，标记位点增多，极大地提高了方法学的灵敏度，并且原子标记对生物质活性影响小，有利于提高方法的稳定性．由于不同的稀土离子具有不同的发射光谱和荧光寿命，利用该特点可以用不同的稀土离子标记不同的抗原或抗体，从而能够在一次分析中得到多个数据，实现多组分的同时检测［16］．

3.5 蛋白质芯片

蛋白质芯片(protein chips)是一种将数种甚至成百上千种已知蛋白质分子固定在芯片基质上的检测方法，从混合样品中捕捉目标分子，再用能与已知蛋白分子特异性结合的蛋白分子对目标分子进行检测，进而分析得知哪些被测样品中含有与已知蛋白分子结合的目标分子．蛋白质芯片的突出特点是可以对样本进行高通量、平行分析，信息量大，目前关于蛋白质芯片技术在食品安全领域的应用已有大量报道．目前，蛋白质芯片技术已逐步推广使用到食品安全领域中，常用于食品中病原微生物的检测、真菌毒素的检测、农兽药残留的检测等，该方法的最大特点是简便、快速、成本低［16］．

4 结束语

随着人们对真菌毒素问题的日益关注和检测技术研究的不断深入，快速、高效、低成本、多通量的环境友好型检测技术和手段是今后真菌毒素检测的发展方向．在未来的真菌毒素检测研究中，通过研究人员的不懈努力，相信可以发掘更多的新方法来提高快速检测和同时检测的效率，开辟真菌毒素联合检测的新领域．

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(责任编辑:王 宽)

Research Progress of Mycotoxin Detection Technologies

SHANG Yan-e
(National Center for Supervision and Inspection of Grain and Oil，Beijing 100162，China)

Some classic mycotoxin detection techniques were reviewed in this paper．The latest development in detection technologies was briefly introduced．And the development trend of mycotoxins detection technology，was summerized．

mycotoxins;rapid detection;multi-component detection

TS207．5

A

1671-1513(2012)04-0015-04

2012-06-26

尚艳娥，女，高级工程师，国家粮油质量监督检验中心总工程师，主要从事粮油安全检测方面的研究．