多肽分子长效研究进展

姜 和，李小华

(1.重庆理工大学 药学与生物学院，重庆 400054;

2.重庆前沿生物技术有限公司，重庆 400041)

多肽药物是生物技术新药的主要品种之一。多肽药物具有活性高、疗效稳定、用量少、毒副作用小等优点，对自身免疫疾病、癌症、心血管疾病、高血压、精神失常等疾病有显著的疗效，且应用范围广泛，因此备受国内外研究者的关注。随着医疗科学的日益发展，多肽类药物已成为21世纪最重要的诊断、预防和治疗药物。但是，多肽分子进入体内后会很快被降解，这是由于人体内含有大量的蛋白酶，能降解多肽分子，使多肽迅速丧失活性。同时由于肾小球的过滤作用和肝脏的代谢作用，多肽很快被清除，使多肽分子在体内表现出半衰期短、稳定性差、生物活性弱等性状。为了维持多肽分子的药效，就需要加大给药频度和剂量，而长期反复注射给药不仅给患者增添了痛苦和经济负担，还会导致各种副作用的产生。因此在药学领域迫切需要研发长效的多肽分子。

体内致多肽分子短效的因素［1］主要有:① 多肽分子进入体循环系统，蛋白水解酶使多肽分子降解为小分子肽或者氨基酸。②多肽分子发生物理或化学上的变化。物理变化包括沉淀、聚集等作用，化学变化包括氧化作用、还原作用、水解作用、脱酰胺反应、糖基修饰等。同时多肽分子周围的环境也会对多肽的稳定性造成一定的影响。③通常较大分子量的多肽通过受体介导的方式来清除，受体介导清除机制可能是一种主要的清除机制。受体介导的清除的限速步骤是药物与细胞表面受体形成非共价键的过程。受体清除具有细胞特异性。④不同的给药途径对多肽药物的体内分布、代谢过程、生物利用度和药理作用都有十分显著的影响。目前，延长多肽分子长效的技术主要有4种:对多肽分子进行化学修饰;把多肽分子与白蛋白进行基因融合;引入抗蛋白酶突变体到多肽分子上;研究多肽分子的长效缓控释制剂。

1 化学修饰

对多肽分子进行化学修饰是一种改变多肽分子主链结构或侧链基团的重要手段，同时还可以改变多肽分子的理化性质。据相关文献［2－4］报道，经过化学修饰的多肽分子能显著降低其免疫原性、降低毒副作用、增加水溶性、延长半衰期、增加疗效和生物利用度。化学修饰是延长多肽半衰期的一个有效途径，是多肽分子长效的重要技术手段之一。当前，在多肽分子长效化中最主要的化学修饰方法有PEG修饰、糖基修饰和定点突变。

1.1 PEG 修饰

聚乙二醇是由环氧乙烷聚合而成，呈中性，无毒，具有良好的生物相容性，也是经过FDA批准的极少数能作为体内注射剂药用的聚合物之一。聚乙二醇具有高度的亲水性和极好的水溶性，并且没有免疫原性。当聚乙二醇偶联到药物表面时，会把它的优良特性赋予药物分子，减少药物的酶降解，避免肾脏代谢，并使药物能被免疫系统的细胞识别。聚乙二醇修饰药物的相对分子质量和注射给药方式会影响它的药代动力性质，一般分子量越大，半衰期越长。通过聚乙二醇修饰技术对多肽进行适合生理应用的改造具有以下优点［5］:半衰期更长，注射频率减小，血药浓度波动小，最大血药浓度较低，毒性较小，免疫原性较小，溶解性更好，治疗费用更低等。多肽的聚乙二醇修饰技术具有广阔的应用前景，已经成为药物化学研究的重点和热点之一。

PEG修饰多肽药物时必须考虑以下几点:首先，PEG修饰物不仅仅是聚乙二醇的聚合物，还可以是聚乙二醇聚合物的一系列衍生物。在选择PEG时必须考虑其对药物生物活性和药代动力学方面的影响，通常采用相对分子质量 40 000～60 000的高分子PEG作为多肽的PEG修饰剂［6］。多肽分子在体内的作用时间与偶联的PEG数量和相对分子量成正比，在体外的生物活性与偶联的PEG数量和相对分子量成反比。其次，PEG修饰多肽分子的位点应根据多肽药物的构效关系进行选择，应选择不与受体结合的多肽表面残基进行修饰，这样修饰的多肽能保持较高的生物活性。

在肿瘤化疗过程中，人体内的中性细胞减少是一种具有潜在危险的不良现象，经常导致化疗时间的延长，影响肿瘤化疗的疗效。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一种多肽细胞因子，是防治肿瘤化疗所致中性细胞减少的有效多肽药物［7］，可以选择性地作用于粒系造血祖细胞，促进其增值、分化，降低化疗后因骨髓功能抑制所感染的发生率，保证化疗顺利进行。rhG-CSF已经广泛应用于临床，但是其半衰期很短，在一个化疗周期中需要连续多次给药，这不但给治疗带来不便，还增加了患者的生理痛苦。由重庆富进生物医药有限公司研制的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)［8］是将重组人粒细胞集落刺激因子经单甲氧基聚乙二醇化学修饰后制成的制剂，具有半衰期长，肾脏清除率慢，免疫原性低等优点。经PEG修饰后的rhG-CSF的半衰期可达到46～62 h，给药频率变为1个化疗周期只需用药1次。

由于尿酸及其盐类在血浆中具有溶解度低、容易沉积的缺陷，会使血浆中尿酸的浓度显著升高，形成高尿酸血症。尿酸酶是一种新型的降尿酸多肽药物，可以促进尿酸分解，对关节性痛风、尿结石及肾功能衰竭所致的高尿酸血症有良效。但尿酸酶是一种外源性蛋白，直接使用会增加其免疫原性，容易产生过敏反应。采用静脉注射的方式将尿酸酶注射到小鼠体内时发现，尿素酶的稳定性差，半衰期短，并产生很强的免疫原性。才蕾等［9］用聚乙二醇(PEG)对尿酸酶进行修饰，发现经PEG化的尿素酶在小鼠体内的半衰期由原来的45 min延长到696 min。由此可见，经修饰后的尿素酶的稳定性显著提高，免疫原性明显降低。

1.2 糖基修饰

糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中最主要的一种手段，对生命体活动起着非常重要的作用。多肽的糖基化修饰能影响多肽的药代动力学作用、生物活性、药物稳定性、对蛋白酶的易感性、水溶性、免疫原性和凝聚性等，是延长多肽半衰期的重要手段之一。

促红细胞生成素(EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样多肽，能促进红细胞增生，主要用于治疗贫血性疾病。EPO本身就是一种高度糖基化的酸性糖蛋白，由165个氨基酸组成，含有3个N－糖链和一个O－糖链。Amgen公司的 Elliott等［10］科学家研制了一种新型的促红细胞生成素(NESP)，在EPO的33位和88位的N－糖链处各增加了一个糖基化修饰。研究表明，EPO经糖基化修饰后，多肽药物的活性不变 ，半衰期明显延长，是EPO的3倍，从而达到了减少给药频率和延长药效的目的。

恩夫韦肽(T－20)是由瑞士罗氏公司和美国Trimeris公司联合开发的由36个氨基酸组成的抗艾滋病多肽药物。T－20在治疗HIV－1感染患者时表现出良好的疗效。然而，把T－20应用于临床时发现它的半衰期仅为2 h左右。由于T－20半衰期短的限制，临床上就必须采用每天注射2次的给药频率来弥补其缺陷。这种频繁给药的方式给艾滋病患者带来极大的生理痛苦，还会在注射部位出现青肿、囊肿、瘙痒、痛疼、潮红等副作用。Thierry Huet等［11］通过糖基修饰技术，用戊多糖(CP)对T－20(enfuvirtide)进行修饰，再用PEG作为CP和enfuvirtide的连接桥梁，最终形成了enfuvirtide-PEG12-CP(EP40111)。通过药代动力学研究发现，经糖基化的恩夫韦肽(EP40111)在人体内的半衰期可达120 h，注射频率由原来的每天2次变为每周1次。并且，糖基化的恩夫韦肽能弥补T－20抑制剂可溶性低的缺陷，减少对注射部位的副作用。

1.3 定点突变

多肽的定点突变是通过对多肽分子的1个或者多个氨基酸进行改变(创造一系列多肽类似物)，从而达到延长多肽半衰期的一种方法。多肽的定点突变是利用寡核苷酸引物、PCR介导的定点基因突变等方法使多肽分子中影响活性或者稳定性的氨基酸发生突变，从而增加多肽的稳定性、生物活性和延长半衰期。

天然的白介素－2(IL－2)是一个由133个氨基酸残基组成的多肽，是机体免疫调节的核心物质，与其他细胞因子共同完成机体免疫功能的平衡调节。IL－2一般用于肝炎、癌症等疾病的治疗，并取得了一定的成果［12］。但大剂量、长期的频繁给药和发热、恶心、呕吐等副作用给患者带来很大的困扰，因此改造IL－2的结构，使其成为具有高活性、低毒性、长效性新型药物势在必行。呈游离状态的Cys－125易形成错配的二硫键配对或形成分子间的二聚体，影响了IL－2的稳定性和生物活性。据报道［13］，科学家利用定点突变的技术，将IL－2的125位Cys突变为Ala，18位的Leu突变为Met，19位的Leu突变为Ser，提高了天然IL－2的稳定性和生物活性。结果显示，IL－2进行定点突变后，活性比天然的IL－2提高了1倍，体内的半衰期由原来的几分钟提高到1.2 h。

为了得到长效的多肽药物，在实际运用中往往采用几种修饰相结合的方法对多肽分子进行修饰。对促红细胞生成素(EPO)的长效修饰，不仅可以采用糖基修饰的方法，还可采用糖基修饰和定点突变相结合的方法。Sinclair等［14］采用定点突变技术，将EPO中的30位、32位、87位、88位和90位氨基酸进行改变;采用糖基修饰技术，在EPO的30位和88位增加了寡糖链，从而使其分子质量由原来的30 kDa增加到50 kDa。采用了定点突变和糖基修饰后的EPO，在慢性肾脏衰竭病人的临床试验中，发现其半衰期由原来的4～13 h延长到 27 ～89 h［15］。

2 基因融合

基因融合技术能增加多肽分子的分子量，改变多肽与受体的亲和性，从而达到延长药物半衰期的效果。基因融合能构建多功能目的蛋白，它是将2个或者多个基因的编码区首尾连接，由同一个调控序列控制基因表达的产物。这种基因融合的技术具有简单灵活的特点，可广泛应用于构建生物活性分子，并且基因融合技术的应用不会受生物分子大小和活性的限制。在多肽的基因融合中，通常选用分子量较大、半衰期较长的分子作为载体构建融合蛋白，应用最广泛的分子载体是人血清白蛋白(HSA)［16－18］。人血清白蛋白是现有的天然载体蛋白之一，它是人体血浆的主要组成部分，在体内参与维持血浆渗透压和运输营养物质，具有人体相容性好、分子量大、半衰期长和无免疫原性等功能。HAS是药物设计的理想载体蛋白，用于改善药物的半衰期，延迟药物的清除，减少注射频率，改善病人对治疗的顺从性和耐受性。

GLP－1(胰高糖素样肽－1)是一种由人肠细胞分泌的内生成多肽，它能促进胰岛素的分泌，是一种治疗2型糖尿病的多肽药物。人体内存在一种二肽基酶(DPP－IV)，这种酶几乎存在于人体的所有组织和器官中，它能使人体的大部分激素多肽失活。当GLP－1进入人体后，它会迅速被DPP－IV降解，并且在2 min内几乎被完全降解。这就意味着GLP－1的半衰期非常短暂，只有2 min左右。Roger Leger等［19］通过化学修饰改变了GLP－1(被DPP－IV酶切)的酶切位点，使GLP－1不能被DPP－IV识别，并且通过对GLP－1的C端的马来酰亚胺修饰，得到了GLP－1的类似物。当GLP－1的类似物进入人体后，能快速与人血清白蛋白融合，生成基因融合物(GLP－1－HSA)。在鼠的试验中，GLP－1－HSA的半衰期显著延长，稳定性增加，生物活性增强。

在临床应用中，常规多肽分子通常受到半衰期短和具有潜在免疫原性的限制，使多肽分子药物的给药频率过高。FB006M［20］是由重庆前沿生物有限公司生产的一种多肽，它是由38个氨基酸组成的HIV－1病毒融合抑制剂，用于治疗艾滋病。发明者对FB006M的13位Lys进行了一个特殊的马来酰亚胺酸修饰，此特殊位点的修饰使FB006M进入人体后，能快速与人血清白蛋白(HSA)按照1∶1的分子比共价结合，形成的结合物为FB006M－HSA。据相关文献［20］报道，在临床试验中，FB006M－HAS表现出半衰期长、治疗方便性高、治疗费用低、毒副作用小等特性，从而使艾滋病患者的生活质量得到改善。

纤溶酶原是一种最新发现的血管生成抑制蛋白，具有明显的血管生成抑制作用。纤溶酶原的结构由5个环组成，其中每个单环和多环的独立结构均有抗肿瘤细胞迁移和抑制肿瘤细胞增殖的作用。在纤溶酶原的5个环中，5号环(K5)抗肿瘤细胞迁移的能力最强，但K5进入人体内后，易被肠激酶降解，导致了其半衰期短。据相关文献报道［21］，K5经马来酰亚胺酸修饰后，进入体内能与人血清白蛋白的34位Cys结合，形成一种基因融合产物K5－HSA。研究发现，K5－HSA在体内的半衰期明显延长，肾脏清除率明显降低，生物活性非常高，还能抵御酶的降解。

3 抗蛋白酶突变体

多肽分子的稳定性是决定多肽药物是否长效的重要因素。多肽分子很容易被血浆或组织中的蛋白酶分解，这种分解作用直接导致了多肽药物的半衰期短，生物利用度低和血浆清除率快，并且蛋白酶对多肽的降解作用发生在吸收、分布、排泄等各个阶段。为了防止多肽被蛋白酶降解，将，1个或多个抗蛋白酶降解突变体引入具有生物活性的多肽分子上，从而提高多肽稳定性，此方法成为了多肽药物设计和发展的研究焦点。

T淋巴细胞表位肽在体内非常容易被亮氨酸氨肽酶降解。为了提高T淋巴细胞表位肽抵抗亮氨酸氨肽酶降解的能力，Marschutz M K等［22］对T淋巴细胞表位肽进行了N端甲基化修饰，引入了抗蛋白酶突变体。经研究发现，在相同的条件下，经修饰的肽90%未被亮氨酸氨肽酶降解，而未经修饰的肽50%未被降解。结果表明，引入抗蛋白酶突变体的T淋巴细胞肽的稳定性和半衰期都强于未经修饰的T淋巴细胞肽。

4 缓控释制剂

延长多肽分子半衰期的方法除了前面提到的化学修饰和基因融合的方法以外，还可以通过缓释或控释的方法对多肽分子进行长效修饰。此方法是在注射液中加入高分子聚合物，提高药物黏度，延缓药物的扩散速度，如水凝胶，纳米胶囊，微球等;或将多肽分子包裹在脂质体中，让多肽药物从脂质体中缓慢地释放出来;或将多肽分子包埋在固体微粒中，让多肽分子从微粒中缓慢释放出来。通常，采用缓控释给药可以减少药物的给药次数，稳定患者体内的血药浓度，延长作用时间，增强疗效和增加药物的长效性。多肽药物的缓控释技术已经成为新型给药技术的热点之一。

NCHG是一种纳米复合材料的生物相容性水凝胶，可用于局部给药，用于治疗牙周感染，它的药效一般在24 h以内。Jozsef Bako［23］等采用缓控释技术，将NCHG包裹入纳米粒子中，形成被纳米粒子包裹的水凝胶(NCHGs)。研究结果发现，NCHGs通过溶胀的方式缓慢释放药物，使其药物释放的周期超过48h，从而达到了增加药物半衰期、延长药物疗效的目的。

5 结束语

近年来，随着生物技术新药的发展，多肽分子因具有安全性高、生物活性好的优点而成为了研究的热点，受到国内外制药行业的广泛关注。但多肽分子类药物在体内不稳定、易被降解、易被肾脏清除，使得其半衰期普遍较短而必须频繁给药，因此研究长效多肽药物成为了必然的趋势。目前，多肽分子长效技术主要有化学修饰、基因融合、抗蛋白酶突变体和缓控释制剂。化学修饰的长效技术应用最为广泛，除了主要的PEG修饰、糖基化修饰、定点突变等，还有C端修饰、N端修饰、侧链修饰、环化等。在所有的多肽长效技术中，它们之间没有独立的界线，各种技术可以相互穿插，相互渗透。

在未来多肽分子长效技术的研究中，可以寻求新的多肽长效手段。可以同时采用多种长效技术对同一个多肽分子进行修饰，即采用复合型的长效技术。可以开发新型缓控释制剂的生物降解材料;可以把缓控释技术与靶向技术相结合，使多肽药物在长效的同时还能精准定位，致力于研究出更加优化更加长效的多肽药物，为多肽分子长效技术锦上添花，为广大病患者造福。

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