骨关节炎动物模型研究进展

郭玉冬，王宸，魏波

(东南大学附属中大医院骨科，江苏南京 210009)

骨关节炎是常见的随着年龄增加的退行性疾病之一［1］。随着社会人口老龄化，其发病率逐年增高，严重危害人类的健康，同时也对社会经济造成极大的负担。骨关节炎动物模型是研究骨关节炎发病机制、危险因素及其治疗方法的重要手段。骨关节炎是一种慢性多因素疾病［2］，其动物模型的制作往往是通过模拟一种或数种致病因素诱发关节软骨的退变来实现。因此目前各种骨关节炎模型从模型动物的选择到模型的制作方法千变万化。在本文中作者检索目前常用的骨关节炎动物模型制作方法，并对其优缺点进行分析和评价。

1 模型动物的选择

针对人类疾病的研究，模型动物的选择要求二者具有同质性:动物模型能够体现出该疾病的遗传因素、自然病程、诱发因素、治疗干预，并且能够用于科学研究。

在开始一个骨关节炎动物实验之前，选择模型动物需要考虑到以下的原则［3］:(1)基因的同质性;(2)营养和运动同质性及可应用性;(3)动物的生存时间、疾病时间、发病年龄、发病率等;(4)匹配的对照群体的可获得性;(5)解剖学及生理学特性，数量上:关节组织是否足够研究?能否获得足够的关节液、关节滑膜;质量上:与人类组织的相似性，为负重关节或非负重关节;(6)标准动物来源充分、动物是否易于控制;(7)费用、伦理问题。

目前用于骨关节炎研究的模型动物品种繁多，各有利弊。主要种属有啮齿类、家禽类、哺乳类以及灵长类动物。啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠;家禽类:鸡、鸭、鹅等;哺乳类:家兔、狗、羊、猪等;灵长类:猿猴、狒狒、恒河猴。以下为最常用的几种动物优缺点的分析。

小鼠:成年小鼠体重20～50 g，寿命约2年，对毒性敏感，雄性相对于雌性更易发病。该动物成本较小、饲养方便、易于获取、重复性好、造模周期短，人类和啮齿类动物在解剖及生理学上相似，故有利于大规模进行纵向临床前研究。目前小鼠基因及可标记基因已经得到很好的注释、翻译，故可用于骨关节炎的基因表达、基因转染、基因敲除等基础研究。因其重复性好、易于获取、造模周期短，可用于大规模药物干预研究及治疗药物毒性研究。但是，小鼠跟人类的基因谱差异较大，和人类膝关节生物力学环境有差异，从而不能完全模拟人类骨关节炎。同时因小鼠关节较小，不利于关节内手术干预(如交叉韧带切除、关节腔注射等)。因与人类疾病形态学上对照有限，每只动物只有少量组织(如关节软骨、关节滑膜)可用于研究，这就形成了它的使用局限性。

大鼠:成年SD大鼠体重300～400 g，寿命约3年，雄性比雌性易于发病，对性激素敏感，其优点与小鼠相似，但费用略高于小鼠。大鼠因终身保持骺软骨也不容易自发形成骨关节炎。SD大鼠关节较大，可行关节腔注射、交叉韧带切除等诱发骨关节炎。大鼠生存能力强，抗感染能力强，手术耐受性较好，目前广泛用于实验室研究。

豚鼠:成年豚鼠体重400～700 g。Hartley豚鼠的膝关节是最常使用的自发性骨性关节炎模型［4］。

家兔:成年家兔体重1.5～2.5 kg，性格温顺，广泛用于实验室研究。家兔因膝关节较大，可行关节内操作，如内半月板切除、交叉韧带切断等诱导骨关节炎的发生。Moskowitz等［5］将兔的部分半月板切除诱发骨关节炎发生。但家兔手术耐受性较差，存活率不如大鼠。

大型动物:如犬、羊、猪，费用更加昂贵，需较大的饲养场地，由于药理学研究需要大量动物，故他们不适宜作药理学研究模型。但是，他们相对于小动物而言更适宜于软骨的力学研究及细胞生物学研究。大型动物可进行关节腔内手术操作，如李忠等［6］用小型猪在关节镜下将内侧半月板切除来诱导骨关节炎获得成功，该方法对关节损伤较小，这是小动物所无法比拟的。

灵长类:恒河猴从5岁开始出现骨性关节炎实验室表现，15年后可发展为临床骨关节炎，这种关节炎在结构、化学、生物力学上均与人类相似［3］。由于时间的作用，这种模型特别适合研究关节软骨的改变。由于关节软骨组织及其分布在骨关节炎的发展中相当重要，这个动物模型在评估这些改变方面就显得相当重要。由于恒河猴在生理上与人类一致，该动物模型对于证实系统因素的作用价值，如肥胖在关节退变中的地位，显的相当重要。因猴居住于热带并食素，揭示了自发性关节退变不依赖于人类饮食习惯及温度气候。骨关节炎在灵长类动物均有发现。缺点是动物来源较少，饲养昂贵。

2 动物模型的分类

骨关节炎的动物模型大致可分为两大类:自发性模型及试验诱导性模型。Arlet等［7］根据病理特点将试验诱导性模型又分为机械性及结构性模型。机械性模型通过改变正常关节组织的生物机械力而诱导骨关节炎。结构性关节炎通过物理、化学、内分泌、生物力学或免疫学改变一个或多个关节组织。

2.1 自发性骨关节炎模型

不仅人类，其他动物亦有可能自发形成关节炎。通常能用于研究的自发性骨关节炎的动物为实验室饲养的小鼠、大鼠、豚鼠、狗，甚至于恒河猴。研究发现小鼠很少发生骨性关节炎，大鼠终身保持骺软骨也是如此。然而，有学者在研究CD/BR大鼠踝关节时发现，26个月的大鼠出现软骨细胞坏死，软骨纤维及软骨下骨重塑［3］。其在组织学上特性与骨关节炎相似。这证明了老年大鼠对骨关节炎易感，然而，相对于人类疾病而言，踝关节并不是一个关节炎好发部位。实验室广泛使用C57B1、STR/IN和NZY/BL种株的小鼠，以及ICR和SAM-P/3DE小鼠的颞下颌关节，该关节在动物2个月大小时即可发现关节软骨表面超微结构的改变，这与人类骨关节炎早期表现相一致。目前小鼠的自发性骨关节炎模型包括:STR/ort小鼠模型［8］、Ⅱ型前胶原基因缺陷小鼠模型(半胱氨酸取代519位精氨酸，Arg→Cys519)等。

最常使用的自发性骨性关节炎模型是Hartley豚鼠的膝关节［9］。雄性Hartly豚鼠软骨降解以负重区软骨组织学改变为主，这与人类骨关节炎发生发展相似，约3个月大的豚鼠体重达到700 g时，其内侧胫骨平台可出现骨性关节炎表现。其组织学表现为软骨表层不平整，软骨细胞减少，胶原不同程度的溶解、断裂及排列紊乱，软骨中糖胺聚糖分布异常。de Bri等［10］和Bendele等［11］报道了不同年龄组的雄性Hartly豚鼠原发性骨关节炎模型，在12及18个月年龄组可观察到关节软骨重度降解。同时，Bendele等［12］发现给豚鼠节食，减轻其体重后，可降低豚鼠膝骨性关节炎的发生率及减轻其发生骨性关节炎的严重程度。Knott等［13］发现给予豚鼠富含η-3多不饱和脂肪酸饮食10～30周后，可缓解骨关节炎易感动物骨关节炎的发展进程。

2.2 试验诱导性生物力学模型

分为关节不稳模型及生物力学负重区移位模型。前者包括髌骨脱位和髌骨切除术、前交叉韧带切除术、半月板切除术等。关节不稳能够避免严重的关节损伤而逐步地反映出所需的关节退变的过程。Pond等［14］在犬的膝关节前交叉韧带切除术及Moskowitz等［5］所制作的兔的部分半月板切除术达到此标准。Bendele等［15］发现，半月板的撕裂较半月板切除更容易诱发骨关节炎。持续的关节不稳可引起软骨及关节下骨的侵蚀退变，这些与自发性骨关节炎相似。研究表明去感觉神经支配本身不能诱导关节退变，但失神经支配可加速犬的前交叉韧带模型的退变［3］。类皮质醇激素治疗能减弱滑膜细胞、软骨细胞和骨细胞的繁殖能力，促进前交叉韧带切断的关节退变。

2.2.1 关节内手术

关节内手术包括多种，最经典的是Hult法。Hult法是目前经典的骨关节炎模型制作方法。主要为麻醉后将动物膝关节前后交叉韧带及内侧副韧带切断，切除内侧半月板，术中避免损伤关节软骨，术后不固定伤肢，动物可自由活动。此方法籍手术形成关节不稳从而诱发骨关节炎，约术后3个月病理可观察到关节软骨破坏、龟裂。方锐等［16］研究发现该方法在兔的膝关节造模后6周为早期改变(滑膜充血、软骨表明面不平整)，8周为中期改变(软骨细胞排列紊乱，基质染色不均)，12周为晚期改变(骨赘形成软骨下骨暴露)。

在该方法的基础上，出现了很多模型制作的新方法。如Armstrong等［17］保留交叉韧带及内侧副韧带，仅切除内侧半月板，半年后观察到软骨细胞肥大、边缘骨赘形成等骨关节炎的表现。特别提出的是Appleton等［18］利用被动活动来加速关节不稳的大鼠膝关节的退变。该试验通过前交叉韧带切除制造雄性大鼠膝关节不稳模型，休息1周后再通过一个特殊的传动装置训练大鼠行走，促使其被动活动(30 min·次-1，3次·周-1)，最早约2周后发现大鼠膝关节软骨退变、软骨下骨改变及软骨下骨丢失。故该作者认为:该骨关节炎模型可用于人类早期或晚期骨关节炎的研究，同时可通过调整被动活动的量来控制骨关节炎发生发展的程度，有利于对该疾病做出进一步的研究。亦有学者通过驱赶大鼠、使用跑步机等，使其被迫活动，促进软骨退变。Welch等［19］发现单纯切除内侧半月板前角的大鼠膝关节在6周内无明显改变，12周后关节评分有显著改变;而同时内侧半月板部分切除模型中，4周时即发现关节评分显著增加。其他的方法主要有:单纯交叉韧带横断术、单纯内侧半月板切除术、内侧半月半部分切除术［20］、关节软骨刻痕术(该方法直接损伤软骨)［21］、髌骨脱位及髌韧带切断术等。

2.2.2 关节腔注射法

关节腔可注射多种药物，通过破坏细胞外基质或关节软骨细胞来诱导骨关节炎。Muehleman等［22］将木瓜酶(Chymopapain)注入新西兰大白兔膝关节通过破坏软骨基质来诱导软骨退变。Kikuchi等［23］通过向兔膝关节腔内注入不同剂量的胶原酶来诱导关节软骨退变。1周后出现组织炎性反应，约6周后组织学可以发现关节软骨及滑膜变性，这与胶原酶剂量呈正相关。Guzman 等［24］将 单 体 碘 乙 酸 (Monosodium iodoacetate，MIA)注入大鼠膝关节，1周内软骨细胞出现变性坏死，部分出现软骨全层性改变。Beyreuther等［25］复制该模型时(50 μl，3 mg MIA)发现 5 d 后大鼠膝关节出现炎症反应。石辉等［26］向兔关节腔内注射尿激酶诱导骨关节炎，发现12周后模型符合骨关节炎组织病理学改变。邓宇等［27］分别向兔膝关节腔内注入二型胶原酶0.5 ml(2 mg)及木瓜酶0.3 ml(4.8 mg)诱导骨关节炎模型，其结论是关节腔内分别注射二种蛋白酶均可成功建立骨关节炎动物模型，低剂量的胶原酶比稍高剂量的木瓜酶更能导致严重的软骨退变。

关节腔内注射药物可分为化学类、酶类、激素类等［3］。化学类包括锇酸、塞替派、秋水仙碱、氮芥、碘醋酸盐、蛋白变性剂(甲醛)。酶类包括木瓜酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶，尿激酶等。激素类包括催产素、肾上腺皮质激素。其他如细菌、酵母多糖、白细胞介素-1、肿瘤坏死因子、转化生长因子-β2。

2.2.3 关节外诱导法

2.2.3.1 卵巢切除术 该方法运用由雌激素的缺乏所致骨关节炎的原理，模拟绝经后骨关节炎，该模型可用于研究雌激素及其类似物对关节软骨的保护作用。Hoegh-Andersen等［28］将7个月大的SP-D大鼠卵巢切除，术后9周可发现轻度的膝关节软骨退变，再过6周却没有进一步的退变。作者还发现关节软骨退变的同时有一过性的尿CTX-2增加。暂时的退变是因为体重增加还是因为雌激素受体减少所致，目前尚不明确。选择性雌激素受体调节剂可用于骨关节炎的早期研究，因时间短、操作容易，特别适用于绝经后骨关节炎的研究。Bellido等［29］通过切除母兔卵巢同时肌肉注射加泼尼龙4周构建骨质疏松模型，第7周行膝关节内侧副韧带切开并切断交叉韧带构建骨关节炎模型，第22周取样观察软骨下骨的微结构的损伤情况，发现骨质疏松能加重骨关节炎软骨下骨微结构的损伤，他们认为早期骨关节炎与骨质疏松共存时，加重软骨下骨的重吸收，促使关节软骨的破坏加重。

2.2.3.2 臀肌切断术 白希壮等［30］通过选择性切断动物臀肌诱导髋关节发生骨性关节炎。结果显示术后12周软骨细胞增生，软骨表面胶原纤维变粗、紊乱、同时出现糜烂及溃疡，与早期骨关节炎表相一致。该方法主要通过改变关节的生物力学环境促使骨关节炎的发生，因手术部位远离关节，避免了手术所致关节创伤及血肿刺激的炎症反应，为研究骨关节炎提供了一个良好的模型。

2.2.3.3 关节固定法 Evans等［31］最早发现在家兔关节制动60 d后出现软骨不可逆性退变。Okazaki等［32］发现家兔伸直位固定膝关节后，约1～2周即可出现关节软骨退变，同时发现p53 mRNA在此过程中发挥重要作用。该模型主要是用石膏固定动物下肢关节，不论是屈曲位、伸直位还是中立位，均可诱发骨关节炎的发生，其原理可能为通过改变软骨的生物力学环节，促使软骨退变。尚平等［33］发现新西兰大白兔膝关节过伸位固定较过屈位固定更易诱发骨关节炎，但两者无统计学差异，同时发现过屈位固定方法简便易行、固定牢固、家兔适用性好、成功几率较高。

2.2.3.4 其他关节外模型 孙刚等［34］通过阻断家兔股静脉及臀下静脉回流，造成膝关节骨内静脉压力增高，在术后8周可观察到骨关节炎改变。该方法可避免关节内手术，但造模时间较长，若联合使用关节固定法，约术后35 d出现骨关节炎改变。刘蜀彬等［35］将兔股骨干骺端髓内血供破坏诱导骨关节炎的发生。贺文楠等［36］通过结扎股静脉并切断腓肠肌内外侧头制造兔的膝关节骨关节炎，发现4周后出现软骨破坏。

3 骨关节炎模型的鉴定

骨关节炎模型的鉴定主要以基因学、形态学、组织病理学、生物化学方面为主。基因学鉴定可通过DNA指纹分析(fingerprinting)［37］。为了在肉眼所见损伤之前评估该模型［3］，有二种技术可以应用:(1)解析MRI及组织影像分析［38］。MRI不仅能确定损失的关节软组织及软骨体积，还能评估关节软骨中的含水量。组织学影像分析技术在数量上能更精细地确定关节内细胞与细胞外基质成分的局部解剖关系。Mohammad等［39］研究表明MRI能够发现早期骨关节炎关节软骨丢失和半月板退变，MRI可通过测量关节软骨厚度的改变而成为骨关节炎早期诊断的一种非侵入方式。(2)共焦显微镜的应用能提供关节组织结构的三维重建，为显示小的结构组成、酶、示踪因子的分布提供了可能。共焦显微镜在动物模型的血清及滑膜液中寻找软骨骨关节炎活动及损伤相关标记物开始崭露头角。但在寻求血清及关节液标记作为临床上评估骨性关节炎程度方面却没用达到预期效果。Umemoto等［40］发现通过用18F-氟化物(2.5 MBq·kg-1)静脉注射后行正电子成像术(PET)可用于发现早期骨关节炎改变。其试验证实:对于大鼠前交叉韧带切断模型，2周后可发现胫骨、股骨内侧有核素浓聚;4周后股骨内侧、胫骨内外侧均有核素浓聚;8周后所有的关节周围均发现核素浓聚。

随着人类生活水平的提高，寿命逐渐延长，骨性关节炎发病率也逐渐增加。目前对于骨性关节炎的病因及治疗并未彻底明确，对于该疾病的研究仍然需花费我们大量的精力。对于该疾病的病因学研究，主要以自发性小鼠模型为主，因其基因已被人类很好的注释，但由于只能获取少量组织学标本，不利于对其进行组织学的研究。而对于已经出现骨性关节炎表现的治疗研究，可用各种关节诱导模型，学者们采用最多的是手术制作的关节不稳模型。这些模型可选择大型动物，如犬类、猪等，有利于我们获取大量组织标本用于研究，但造模时间较长，花费较多。

目前尚没有一种完美的动物模型，需要进一步探索及开发最好的动物模型。在此之前我们需要熟悉各种动物模型的特点，根据自己研究的需要，选择最合适的动物模型。

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