MicroRNA在冠心病中的作用研究

蒋珽，项阳

(南京大学生命科学学院，江苏南京 210093)

MicroRNAs(miRNAs)是一类存在于真核细胞胞质中非编码蛋白质的小RNA，约含18～22个寡核苷酸，在生物进化过程中具有高度的保守性［1］。它通过碱基互补配对的方式与靶mRNA 3'端非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)结合，抑制该 mRNA的翻译过程，从而调控基因表达［1］。miRNAs在生物体的物质代谢、细胞生长发育、分化与凋亡等一系列生命活动中发挥重要作用。目前在人类基因组中已经发现了约800种miRNAs，估计总共有超过1 000种miRNAs在人类基因组中表达［2］。冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是心血管疾病中的常见病，具有高发病率和高致死率的特点，严重威胁人体健康。作者对miRNAs与冠心病的关联以及miRNAs在冠心病的病因、诊断、治疗方面的研究进展进行综述。

1 miRNAs的发现

1993 年，Lee等［3］在研究线虫(C.elegans)发育时发现了第1个miRNA基因lin-4。Lin-4基因编码22个核苷酸的单链RNA，在线虫发育早期，lin-4通过结合到mRNA Lin-14的3'-UTR，抑制Lin-14的蛋白表达。但此发现一直未能引起很多关注，直至2000年时，Reinhart等［4］在线虫中鉴定出另一个miRNA基因let-7，此时miRNA家族才迅速进入人们视野，紧接着在拟南芥、果蝇、小鼠以及人类等各种生物中都相继有miRNA的报道。近年的研究表明，miRNA在一些疾病，例如心脏疾病和癌症过程中扮演着重要的角色。因此有关miRNA的研究，对于医学、分子生物学都有着非常重要的意义［5-6］。

2 miRNAs的生成及作用机制

首先携带miRNA信息的基因在细胞核内通过RNA聚合酶Ⅱ转录生成一种较长的初始转录RNA，即前体miRNA(pri-miRNA)，然后pri-miRNA会再被叫Drosh的RNA内切酶Ⅲ剪切成含有茎环结构的70个碱基左右的RNA，即初级 miRNA(pre-miRNA)。随后，pre-miRNA被转运蛋白Exportin-5从细胞核转运到细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA会从载体蛋白中脱落下来，被一种叫做Dicer的RNA内切酶Ⅲ剪切成22个碱基左右的成熟双链miRNA。此双链miRNA中的一条会被降解，另外一条5'端热稳定性较差的RNA将被特异性地整合到RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中形成 miRISC，从而发挥生物学功能［7-9］。

我们通常认为miRNA是通过下面的方式来调节基因表达的:成熟miRNA单链的5'端有一个称为种子序列的7nt序列，它会结合在位于靶基因mRNA的3'UTR的蛋白编码基因上并与之相互作用，识别靶mRNA。当miRNA序列与靶基因mRNA的3'UTR完全匹配时，miRNA促使靶基因的mRNA发生降解;当miRNA通过与3'UTR的不完全匹配结合，miRNA阻碍靶基因mRNA的翻译，但不影响靶基因mRNA的稳定性［10］。

3 miRNAs与冠心病的关联

近年来研究表明，miRNAs与心血管疾病紧密相关。其中miR-1和miR-133被发现与多种心脏疾病相关，miR-1、miR-133 有可能是心律失常的致病因子［11］，抑制miR-1和miR-133的表达会促进心肌肥大［12］，且对心功能有保护作用［13］。而miR-21通过控制心肌间质纤维化的范围，对抗心力衰竭［14］。miRNA与冠心病也具有密切的关联:血管内皮源性的miRNAs(miR-17、miR-26和miR-92a)在冠心病患者血浆中明显低于非冠心病者;同样活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核-巨噬细胞中高度表达的miR-155在冠心病患者血浆中也明显低于非冠心病者;相反，心肌源性的miRNAs(miR-133，miR-208a)则显著高于非冠心病者［15］。Cheng等［16］发现通过结扎冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的小鼠血清中miR-1水平与对照组相比在心梗后6 h升高了200倍，心梗3 d后miR-1降至正常水平，并且心梗小鼠血清中miR-1水平的升高与其心肌梗死面积呈正相关。同时，他们通过临床研究还发现AMI患者血清miR-1水平与对照组相比在心梗后6 h升高了100倍，且其血清miR-1水平的升高与肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平的升高呈正相关［16］。Jing 等［17］发现AMI患者血浆miR-1水平显著高于非AMI者，而在经过2周的住院治疗后miR-1下降回正常对照组水平。统计分析显示，AMI患者血浆miR-1水平的升高与患者年龄、性别、血压、是否合并糖尿病没有关系，而与患者的QRS波变化相关。

另一方面，针对细胞中的 miRNA，Menno等［18］发现冠心病患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的miR-135a与未患冠心病的对照组相比升高5倍，而miR-147下降4倍，导致miR-135a/miR-147升高19倍(P＜0.001)。与此同时，通过miRNA目的基因的生物信息学分析提示冠心病患者的PBMCs中miRNAs的变化与细胞内cadherin/Wnt信号改变有关。另外，他们还发现不稳定型心绞痛患者 PBMCs中 miR-134、miR-370、miR-198较稳定型心绞痛患者分别升高3.5倍、3.1倍和12倍。这一观察结果提示，miRNAs能对心绞痛患者进行危险分层，辨别出具有发生急性冠脉综合征风险的人群。miRNAs不仅与冠心病关系密切，而且具有对不同冠心病类型进行临床分型的潜能。另外冠心病患者并非所有的miRNAs都高于非冠心病患者，冠心病患者血浆中不同的miRNAs呈现出不同的变化趋势，造成这一现象的原因还有待进一步研究。

4 miRNAs与冠心病的病因

冠状动脉粥样硬化形成粥样斑块使血管管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧而坏死引起冠心病［19］。粥样斑块的形成是慢性炎症反应的过程［20］，巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)后引发炎症反应是动脉粥样硬化发生和发展的病理基础。有研究用oxLDL刺激人巨噬细胞，发现巨噬细胞中miR-125、miR-9、miR-146和miR-155等表达异常。而生物信息学研究提示miR-125在oxLDL刺激的巨噬细胞中可以调节脂质的摄取以及炎症细胞因子分泌的减少［21］。MiR-126能够抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的血管黏附细胞因子1(VCAM-1)的表达，并限制白细胞在血管内皮的黏附。已证实VCAM-1是miR-126的靶基因，敲除miR-126反义寡核苷酸可导致TNF-α诱导的VCAM-1表达上调，从而促进白细胞向内皮细胞的黏附［22］。可见，miR-126具有调控黏附分子表达及血管炎症反应的功能，并能通过抑制VCAM-1的表达在动脉粥样硬化的发展过程中起保护作用。

内皮损伤被认为是动脉粥样硬化发生发展的经典刺激因素，而内皮祖细胞(EPCs)在维持内皮的完整性以及内皮细胞更新过程中起关键作用，冠心病患者循环系统中EPCs数量与年龄和性别相似的非冠心病患者相比降低，炎症反应及氧化机制致EPCs的数量和功能损伤性变化与心血管疾病启动、进展和并发症发生有关。EPCs数量减少导致血管炎症，导致动脉粥样硬化斑块破裂、血栓形成，增加冠心病发病的风险［23］。另有报道冠心病患者miR-221/miR-222的表达水平与EPCs数量的变化相反［29］。在球样损伤的大鼠颈动脉血管壁上miR-21的表达增加，而敲除miR-21可减轻血管内膜病变。在体外实验中发现miR-21的表达在已经分化的血管平滑肌细胞中明显高于刚分化的血管内皮细胞;敲除miR-21剂量依赖性地导致细胞增殖减少、凋亡增加，并且这些结果都在大鼠体内实验中得到验证［24］。细胞研究结果提示，抑制miR-21的功能可能具有抗动脉粥样硬化作用。

冠心病发生主要涉及血管内皮功能和形态的损伤;细胞凋亡，内膜下脂质沉积;单核细胞与内皮黏附而进入内皮下并转变为巨噬细胞吞噬脂质;血管平滑肌细胞增殖并向内膜迁移，以及合成细胞外基质等［25］。miRNAs在冠心病发病机制的各种因素中都有作用，无疑可为冠心病这一顽疾提供新的攻克方向。

5 miRNAs对冠心病的诊断

AMI是冠心病中的一类高风险疾病，发病急，病情变化快，临床上要求做到早期诊断、早期干预。要达到这一目的，必须有敏感性高、特异性强的心肌损伤标记物作为诊断的工具。而近年来很多相关研究表明，循环miRNAs的表达水平及活性变化参与某些疾病病理过程，因其在检测中有独特的优势，在心血管疾病的诊断及治疗中有非常重要的意义。Jing等［17］的研究发现miR-1有可能成为诊断AMI的特异性标记物。他们用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析non-AMI和AMI病人的曲线下面积为0.774，而治疗前后比较其曲线下面积达0.852。Xu等［26］通过静脉注射异丙肾上腺素建立大鼠心肌缺血的动物模型，然后用miRNA微阵列分析得出miR-208是心脏特异性的miRNA这一结果。同时他们在大鼠被诱导心肌缺血后不同时间段采血检测血浆miR-208及肌钙蛋白I(cTnI)，发现大鼠在心肌梗死后6 h内，二者具有相似的时间变化趋势。6 h以后两者变化趋势不同:其中miR-208呈逐渐下降趋势，而cTnI则继续升高。虽然如此，但miR-208在心梗后12 h相对于其本身的最初正常水平仍然显著升高。这些结果提示，miR-208有可能成为一种新型心肌损伤标记物，循环miRNAs表达谱可能成为冠心病的诊断标记物。

Wang等［27］通过 Northern Blot和 Real-Time PCR技术分析 4 种 miRNAs(miR-1、miR-133a、miR-499、miR-208a)在大鼠和人体不同组织中的表达情况，发现无论在大鼠还是人体内，正常状态下检测不到miR-208a，且只有受损的心脏组织中才能检测到miR-208a。此外，他们通过切开胸廓造成大鼠骨骼肌损伤，通过结扎冠状动脉左前降支造成大鼠心肌损伤，发现心肌损伤1 h内大鼠血浆miR-208a即会明显升高;如果未损伤心肌而只损伤了骨骼肌，则miR-208a不升高。而miR-1、miR-133a、miR-499不仅在损伤心肌时升高，在损伤骨骼肌时同样会升高。进一步研究发现这4种miRNAs在心梗患者血清中都明显高于正常人以及其他患心血管疾病的病人;并且通过ROC曲线证明了miR-208a有很高的灵敏性和特异性，其曲线下面积达0.965。这些结果表明，miR-208a具有高度的心肌特异性。部分AMI患者接受冠状动脉介入治疗和药物治疗2个月后复查，以上4种miRNAs与发病时相比均下降明显，miR-208a含量下降至无法检出的水平。而在另一方面，Wang等［27］发现在AMI发病早期4 h以内miR-208a即能够被检测到，而此时cTnI含量还在能被检测到的阈值之下。研究者认为大部分cTnI主要与肌原纤维结合，细胞质内仅占2.8% ～4.1%，而miRNAs则在细胞质中含量丰富，心肌细胞的损伤会导致miRNAs释放到血液中去。这提示miR-208a可能是一种有意义的早期AMI诊断的生物标记物，对于早期接受手术治疗挽救心肌有至关重要的意义。另外，有研究者也观察了AMI发生早期外周血中全基因组的 miRNAs表达水平，检测发现了121种miRNAs的表达有显著变化，其中miR-1291和miR-663b区分病人和正常人的敏感性和特异性最高。研究还发现其中20种异常表达的miRNAs可以作为预诊AMI的指纹图谱，其诊断的灵敏度、特异度及准确度分别为96%、90%、93%;另外miR-30c和miR-145与心肌梗死面积呈正比［28］。

上述结果提示，miRNA-1、miRNA-208、miRNA-499等在心肌急性损伤过程中释放异常增加，将来有可能成为一种继肌钙蛋白、肌红蛋白及CK-MB后更早期诊断AMI的新型心肌标记物。

6 miRNAs与冠心病的治疗

从基因水平治疗疾病是当前生物医学研究的热点。针对冠心病的治疗目前临床上除了经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)外，还有他汀类降脂药、β受体阻滞剂等经典药物治疗。而miRNAs能够成为这些经典药物治疗冠心病的靶点，使从基因水平治疗冠心病成为现实。Minami等［29］研究发现冠心病患者EPCs中的miR-221/miR-222显著高于非冠心病者，而在冠心病患者中这两种miRNAs的表达含量与EPCs的数量呈一定的负相关性。经过12个月的治疗，阿托伐他汀能够降低冠心病患者EPCs中miR-221/miR-222的水平从而增加EPCs数量，使冠心病患者受益;而普伐他汀在治疗冠心病患者时作用相对弱得多。同时他们还发现运用降脂与阿托伐他汀同时治疗能显著增加EPCs数量，降低miR-221/miR-222的水平，而这种治疗方式在普伐他汀组中不能改变miR-221/miR-222的水平和EPCs数量。这一研究结果提示miRNAs能够成为部分但并非所有他汀类降脂药治疗冠心病的靶点。其他miRNAs是否也能成为他汀类降脂药的干预靶点尚不明确。此外，就干预miRNAs靶点进行治疗这条途径而言，不同种类不同剂量的他汀类降脂药对不同类型的冠心病产生的疗效如何也有待进一步的研究。

经典的β受体阻滞剂普萘洛尔是一种临床上用于治疗冠心病的常用药物，尤其在预防AMI患者发生心源性猝死方面发挥重要作用。Yanjie等［30］通过研究说明普萘洛尔可以降低因心肌缺血而引起的miR-1的表达增加，使之表达水平正常;并且普萘洛尔可以缓解心肌缺血时心肌损伤、膜去极化的修复及心脏传导变缓。研究进一步揭示心肌梗死大鼠体内β肾上腺素能受体被刺激时会引起环磷酸腺苷(cAMP)水平的升高，而后者再激活蛋白激酶 A(PKA)，进一步刺激miR-1的表达。β肾上腺素能受体-cAMP-PKA信号通路在心脏诸多病理改变的过程中都很常见，而miR-1很可能与这些改变相关［30］。此外，miR-1的表达依赖于将血清反应因子(serum response factor，SRF)绑定于它的活化区域［31-32］。Yan等［30］发现使用异丙肾上腺素刺激大鼠β受体会引起SRF升高同时伴随miR-1水平的升高。而心梗大鼠的SRF显著升高且这种升高能够被普萘洛尔所抑制。综上所述，β受体阻滞剂通过阻断β肾上腺素能受体-cAMP-PKA信号通路和抑制SRF表达这两条途径下调miR-1的表达，减少缺血性心律失常发生的几率，从而发挥其心血管保护作用。

7 展 望

miRNAs是基因表达调控网络中新近发现的成员，近年来将其作为调控因子广泛深入地研究，取得了诸多进展。而冠心病是心血管疾病中的常见病，一直以来同样被广为研究。目前在冠心病领域的miRNAs研究取得了部分成果，在这一方面还有更多的研究拓展空间。首先，miRNAs影响冠心病病因的分子机制还有待更进一步的阐明;其次，miRNAs对不同类型的冠心病诊断价值如何，是否能够在将来取代 cTnI、cTnT、CK-MB成为更优异的心肌标记物;最后，miRNAs是否能够成为更多药物干预的靶点从而达到治疗冠心病的目的。综上所述，miRNA在临床诊疗冠心病方面的应用仍需要不断研究、探索、尝试，最终才能实现。

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