经典Wnt信号通路对成骨细胞增殖和分化的影响*

唐 泉 孙元明

骨的重建由骨的生成和吸收构成，成骨细胞具有骨的形成功能，破骨细胞具有骨吸收作用。两者之间的动态平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。其中任何一个阶段出现异常时，都会对骨量和骨的组成产生重要的影响。

Wnt蛋白家族为一类高度保守的蛋白家族，其与一系列的生物过程，如胚胎发育、器官生成及肿瘤形成等有关[2]。Wnt蛋白在成骨细胞中可以通过经典Wnt信号通路调节成骨细胞的增殖和分化，参与骨发生过程的调节。经典Wnt信号通路的活性降低时，会产生骨组织的畸变[3]。经典Wnt通路中各种成分如低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5、β-catenin等也均分别可以对成骨细胞的发育过程产生影响，还可能导致骨质疏松症或者骨质减少等疾病[4]，现已成为研究成骨细胞代谢的重要靶点[5]。本文对其在成骨细胞的调节中所起的作用进行综述。

1 经典Wnt信号通路

Wnt家族由19种高度保守的富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白组成[6]，大小为39～46 ku。Wnt通路的命名来源于其家族中前两个成员：小鼠中的int和果蝇中的wingless。所有的Wnt蛋白含有23～24个半胱氨酸残基，大部分氨基酸残基可以形成分子内二硫键并进行转录后修饰。Wnt蛋白与由Frizzled（FZD）、G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor，GPCR）和低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein recep⁃tor-related protein，LRP）构成的膜受体复合物结合。这种结合可以激活两条信号通路：经典Wnt信号通路（Wnt/β-catenin信号通路）和非经典Wnt信号通路（Wnt/Ca2+信号通路等）[7]。调节骨形成的信号通路主要是LRP5/6的下游信号通路[8]。经典Wnt信号通路主要通过调节转录辅助激活因子β-catenin的数量发挥作用[9]。

经典Wnt信号通路对于成骨细胞的影响首次发现于其对人类骨质疏松症-假神经胶质瘤（osteoporosis physiology，OPPG[10]）综合征和由LRP5基因突变导致的高骨量（high bo⁃nemass，HBM[10]）表型的研究中。通过LRP5突变的基因敲除和转基因小鼠模型可以弄清楚经典Wnt信号通路如何控制骨的形成。

对β-catenin在细胞和亚细胞中位置的调节是经典信号通路影响细胞功能的核心[11]。当Wnt通路未被激活时，β-catenin水平维持在一个稳定的水平。部分β-catenin被多蛋白复合体磷酸化[12]，该复合体包括：蛋白激酶1（casein ki⁃nase 1，CK1）、糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）及支架蛋白等。然后β-catenin被定向泛素化进而通过蛋白酶体机制降解[13]。当Wnt通路被激活后，Wnt蛋白首先与细胞表面受体复合物（由LRP5和人卷曲蛋白Fzd构成，Fzd是一种跨膜蛋白）结合[14]，然后LRP5被GSK-3β双磷酸化，这一作用将体轴发育抑制因子Axin募集到膜上，复合物与Axin结合，使得细胞表面受体复合物与CSK-3β分离，该过程的具体机制还不清楚，可能是因为LRP5与Axin的结合是一种竞争性的对GSK-3β结合蛋白的活化。CSK-3β可以通过磷酸化β-catenin起到对其抑制的作用。抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化作用是经典Wnt信号通路中重要的一步[15]。GSK-3β与其结合蛋白结合，失去磷酸化β-catenin的功能。没有被GSK-3β磷酸化的β-catenin在细胞内积累到一定程度后，将对细胞核内基因的表达产生一定影响。淋巴细胞增强子结合因子LEF（lymphoid enhancer binding factor）和T细胞因子TCF（T-cell factor）是β-catenin在细胞核内最典型的作用因子。β-catenin替代辅阻遏物（co-repressor，CoR）直接与LEF/TCF结合并互相作用，并且募集辅助转录激活因子刺激许多基因的表达，包括原癌基因c-myc和细胞周期蛋白D等。

2 经典Wnt信号通路对成骨细胞的影响

经典Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞分化为骨组织的脂肪细胞和软骨细胞方面的研究已有报道，其对成骨细胞的调节也有一定的研究。经典Wnt信号通路可以从增殖和分化水平上对成骨细胞进行调节。

经典Wnt信号通路的激活可以增加成骨细胞的增殖[16]。LRP5基因双缺失的小鼠体内成骨细胞的增殖减少，而LRP5（G171V）的转基因小鼠体内成骨细胞的数量显著增加，而且颅骨中凋亡的成骨细胞和软骨细胞的数量也减少。Wnt10b基因在间质细胞中的过表达在体内会使骨密度增加，小梁骨的数量和厚度也都增加，在体外可以促进成骨细胞的发生过程[17]。在成年小鼠体内，Wnt拮抗物（分泌型卷曲相关蛋白Sfrp1、异藻蓝蛋白Apc、抑癌蛋白Dkk）的表达钝化或减少可以显著增加小梁骨的骨量。

Wnt信号通路对成骨细胞分化的各个时期都具有调节作用。Wnt蛋白可以刺激成骨细胞分化过程中的一些早期事件并促进前体细胞的生长。在C3H10T1/2、C2C12、ST2细胞系中，一些Wnt蛋白（Wnt3a）可以诱导碱性磷酸酶（ALP）的活性，这是成骨细胞分化早期过程中的重要事件。尽管Wnt3a可以引起ALP活性的显著改变，但是成骨细胞的其他标记如Runx2、骨钙素、I型胶原却不受Wnt分子的影响。在成骨细胞分化阶段，Wnt信号通路中的一些关键成分的表达会受到调控。Wnt信号通路的拮抗剂，如Sfrp2、Dkk1、FrzB，在成骨细胞分化的后期表达量都明显增多，表明一种对Wnt的负反馈调节可能控制成骨细胞成熟的最后阶段。其次LRP5缺失小鼠表现出骨质沉积减少。成骨细胞内β-catenin过表达时，胶原I型a1和a2的表达量也增加。

2.1 Wnt受体LRP5对成骨细胞的影响 LRP5属于低密度脂蛋白受体相关蛋白家族，是一种跨膜蛋白，编码1 615个氨基酸。细胞外结构主要有N末端6xYWTD重复序列和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样序列构成，这种结构重复4次，末端连接1个低密度脂蛋白（low-density lipopro⁃tein receptor，LDLR）样的配体结合区，能够通过受体介导的胞吞作用与配体结合。

成骨细胞中Wnt信号通路重要性的发现表明Wnt受体LRP5的激活可以导致骨量增高，失活则可以导致骨质疏松症。对若干受到OPPG影响的家族和OPPG患者进行研究，发现LRP5缺失的突变个体会产生OPPG[10]。OPPG是一种罕见的可导致骨骼失衡和眼睛紊乱的常染色体隐性遗传疾病，是由于LRP5基因的功能缺失导致的。OPPG患者的主要症状是骨量很低，而且有产生骨骼断裂和变形的倾向。对使LRP5的功能增加的突变基因进行研究表明，LRP5功能增加的突变体的骨密度增加，具有HBM的特性[18]。对这些重要的发现在小鼠模型中得到进一步的确认，对小鼠进行LRP5基因敲除和引入功能增加突变会产生与OPPG和HBM相同的表型。对LRP5基因敲除小鼠模型的培养表明缺少LRP5基因时，成骨细胞的数量和增殖率会减少，而对成骨细胞的凋亡无影响[19]。缺失LRP5对成骨细胞的凋亡和分化无影响，同样LRP5的缺失对成骨细胞的发生和骨吸收也无影响。这表明LRP5的缺失会减少小鼠的骨量是由于骨细胞的增殖和活性降低造成的。相反，对LRP5功能增强的小鼠模型LRP5G171进行研究，发现小鼠体内骨量和骨强度增加，ALP活性增加，成骨细胞的凋亡减少，但细胞的活性、数量和骨吸收量无改变[5]。这说明高骨量小鼠骨组成增加是由于成骨细胞的凋亡减少成骨细胞的数量增加引起的。

2.2 β-catenin对成骨细胞的影响 β-catenin是一种与细胞黏附有关的细胞内分子，通过与E-钙黏着蛋白和α-catenin相互作用影响黏附作用。通过Wnt经典通路，β-catenin在细胞质中稳定和积累，然后进入细胞核与LEF/TCF转录因子结合以调节Wnt通路的靶基因。在成年人体内，β-catenin的缺失可以减少成骨细胞的数量，增加破骨细胞的数量[20]，从而影响骨的生理功能。

β-catenin在骨的发生中具有多种作用。在α1（Ⅱ）-colla⁃gen-Wnt14转基因小鼠中软骨细胞中的异位Wnt信号通路使软骨细胞成骨增强并且抑制软骨生成。相反，在α1（Ⅱ）-col⁃lagen-Cre转基因小鼠中，β-catenin失活，能够导致异位的软骨形成和成骨细胞的分化。这说明由β-catenin介导的Wnt信号通路对成骨细胞的分化具有重要的抑制作用。但是在小鼠已分化的成骨细胞中β-catenin的缺失不会产生LRP5缺失时产生的那种表型和分子水平的异常，这种突变主要通过影响成骨细胞中骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的形成，进而增加破骨细胞的数量，影响骨的吸收[21]。

2.3 糖原合酶激酶3（GSK-3）β GSK-3是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，对细胞内的多个过程都具有调控作用[22]。在哺乳动物中有两种亚型，α型（51 ku）和β型（47 ku）[23]。在Wnt信号通路的细胞内影响因子中，最有可能成为药物靶点的便是GSK-3β。GSK-3β有2个特性：一是其在细胞中一般是有活性的，主要是通过抑制其活性对其进行调节。二是它能够优先结合已被其他激酶磷酸化的亚基。

GSK-3β抑制剂可以诱导成骨细胞的分化和骨的组成，增加骨量和骨强度。在一些小鼠模型中使用GSK-3β抑制剂（如LiCl等）[11]时，骨形成会加强，骨量会增加。锂能够缓解LRP双基因缺失的小鼠体内骨质减少的现象，并且可以达到与野生型骨质水平基本一致的效果。锂作用于野生型小鼠时，会增加其骨量。在切除卵巢的大鼠体内给予GSK-3β抑制剂，网状的皮质骨的矿化含量和骨矿物质密度（bone miner⁃al density，BMD）显著提高。这些都表明锂或者其他抑制剂剂对GSK-3β的修饰可能会具有治疗骨质减少的作用。

3 结论

骨的重建过程是骨的动态本质[24]，与骨的形成过程相同，也是通过破骨细胞的吸收和成骨细胞的形成相互平衡来确保骨重建过程的正常进行。经典Wnt信号通路可以调节成骨细胞，并且对其在成骨细胞内的作用过程，即组成通路的成分有了一个大概的了解，对经典Wnt信号通路如何影响成骨细胞的增殖和分化虽然有了基础的认识，但是随着对信号通路的深入探索，发现与此通路相关的成分越来越多，很多问题还有待解决。

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