多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶改变

张晔 张艳 周郦楠

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病。全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位，它已成为人类死亡病因最高的头号杀手。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”即“四高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人，每年死于心脑血管疾病近300万人，占我国每年总死亡病因的51%，且呈迅速上升趋势。其中又以多发性脑梗死(Multiple Cerebral Infarction，MCI)的发病率占的比重最大。研究其发病机制、治疗措施对提高人类生活质量具有重要意义。

Papez回路已被普遍认为参与认知过程，包括记忆功能和空间短程记忆功能。此回路由海马经乳头体(mammillary body)和前丘脑至扣带回皮质。其中乳头体是下丘脑的重要组成部分，是海马主要的输出结构。乳头体病变时，可出现记忆力障碍、意识水平下降、情绪改变、痴呆及昏迷等症状［1］。本实验通过对多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶的变化，以探讨乳头体与多发性脑梗死的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康成年Wistar大鼠40只，雄性，体重250～300 g，由中国医科大学实验动物中心提供，复合颗粒饲料饲养，自由饮水和活动。常规适应环境5 d后，随机分为3组:正常对照组、缺血对照组、实验组(术后4 h取材)。

1.2 实验方法

1.2.1 多发性脑梗死模型制备 按40 ml/kg体重注射1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，平甲状软骨高度做一偏左纵向切口，暴露左颈内动脉与颈外动脉分叉处，并对境外动脉进行充分剥离。在颈总动脉及颈内动脉远心端，分别用显微外科动脉夹进行无损伤夹闭。用显微外科直剪在颈外动脉上剪一斜口，由远心端向近心端插入静脉留置针，结扎固定，拔出针芯，放开颈内动脉的动脉夹，推入肝素盐水0.2 ml(含肝素10 U)，25 g/L同种属大鼠全血悬浊液0.5 ml。注射完毕，立即将颈外动脉剪口近心端处结扎，放开颈总动脉的动脉夹，观察、逐层缝合［2］。

1.2.2 缺血对照组动物模型制备 按40 ml/kg体重注射1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，平甲状软骨高度做一偏左纵向切口，暴露左颈内动脉与颈外动脉分叉处，并对颈外动脉进行充分剥离。在颈总动脉及颈内动脉远心端，分别用显微外科动脉夹进行无损伤夹闭。用显微外科直剪在颈外动脉上剪一斜口，由远心端向近心端插入静脉留置针，结扎固定，拔出针芯，放开颈内动脉的动脉夹，推入0.7 ml生理盐水。注射完毕，立即将颈外动脉剪口近心端处结扎，放开颈总动脉的动脉夹，观察、逐层缝合。

1.2.3 取材切片 大鼠经1%肝素钠生理盐水、含4%多聚甲醛的0.1 m磷酸盐缓液(PBS，pH=7.4)固定液内固定灌注，取出脑组织并置于固定液中后固定4 h，然后将脑组织切成薄块移入含20%蔗糖的0.1 m磷酸盐缓液(pH=7.4)中4℃保存，至组织沉底，作冠状位连续冰冻切片，片厚20 μm。

1.2.4 尼氏染色 将冰冻切片吹干，用0.1 m磷酸盐缓液(pH=7.4)漂洗3次(5 min/次)，将切片放入1%甲苯胺蓝溶液(37℃)，90 min后取出用蒸馏水冲洗，再用0.1 m磷酸盐缓液漂洗3次(5 min/次)，常规脱水、透明、封片，光镜下观察。

1.2.5 一氧化氮合酶组织化学染色 用0.1 m磷酸盐缓液(pH=7.4)彻底漂洗切片;室温下，在0.2%Tritonx-100PBS溶液中预孵育10 min;37℃下，在孵育液(NADPH-d 10 mg，NBT 5 mg，Tritonx-100 0.03 ml，用PH=7.4的0.1 m磷酸盐缓液溶液配置成100 ml)中反应2～3 h;用0.1 m磷酸盐缓液(PH=7.4)终止反应，并漂洗3次(1 min/次);常规脱水、透明、封片。

1.3 图像分析 用Luzex-F显微图像分析仪测定大鼠乳头体单位面积nNOS阳性细胞及纤维的平均灰度值。

1.4 统计学方法 所有实验数据用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用t检验方法。

2 结果

2.1 尼氏染色结果 正常对照组和缺血对照组尼氏染色切片上，神经元数量多，排列紧密，形态完整，泡浆内尼氏体丰富。MCI4 h实验组大鼠乳头体切片上，正常神经元数量减少，细胞皱缩，有的呈空泡样甚至溶解成碎片。

2.2 超微结构观察 MCI4 h实验组大鼠乳头体神经元有明显改变:粗面内质网扩张，呈裂隙状或密集条纹;线粒体肿胀，嵴紊乱甚至缺失;核皱缩，核膜部分溶解、消失;突触数量减少，前后膜融合，突触小泡不清或出现聚集。根据尼氏染色和超微结构观察结果证明MCI动物模型制备成功。

2.3 NOS组化结果 光镜下MCI大鼠乳头体nNOS阳性神经元呈棕褐色，多数为中小型细胞，胞体多呈卵圆形，突起较少。MCI 4 h实验组大鼠乳头体切片上，正常神经元数量减少，NOS阳性细胞数量增多，细胞小，形态不同于正常NOS阳性细胞。

2.4 图像分析结果 MCI4 h实验组大鼠乳头体nNOS阳性神经元数量与平均灰度值(43.09±3.95，183.69±3.80)均大于正常对照组(39.33±2.27，179.70±2.60)(P＜0.05)。

3 讨论

本实验结果中，MCI时，大鼠乳头体NOS酶反应阳性细胞及纤维数量显著增多，这一实验结果尚未见报道。一氧化氮(NO)是生物体内的一种重要信使分子，参与脑的多种生理病理过程［3］。作为一种活泼的自由基，NO既能作为神经信息分子发挥作用也可成为神经毒性物质。催化NO生物合成的酶称为一氧化氮合酶(NOS)，是NO合成过程中的重要限速因素，体内NO的生物作用完全依赖于NOS的活性［4］。NO的半衰期很短，直接研究尚有困难，因此，对NOS的测定是深入研究NO生理病理作用的重要环节。NOS有三种亚型，即神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)及内皮型(eNOS)，各型在脑组织中的分布以及在脑缺血中的作用各不相同［5］。有研究认为，神经元内NOS主要是nNOS。

鼠类乳头体位于正中，不像灵长类等高等动物的乳头体左右成对酷似乳头。乳头体和海马一样也是脑内易发生缺血的部位之一，进化越高的组织对缺血的耐受性越差。乳头体浅部覆有薄层白质纤维，内部含有数个核团，分为乳头体内侧核、乳头体外侧核、乳头体前核、乳头体后核及乳头体上区。其中乳头体内侧核神经元较易发生缺血改变，而外侧核乳头体内侧核组成却较少发生。乳头体内侧核组成乳头体的主要传导系统乳头丘脑束和乳头被盖束，为其边缘系统Papez环路的重要部分［6］。

本实验运用酶组织化学方法证明了MCI 4 h时，大鼠乳头体NOS酶反应阳性细胞及纤维数量显著增多，结果提示NOS参与MCI的病理生理过程，可作为神经元受损的标志物。

［1］刘鸿宇，药宏亮，崔建梅，等.运动性疲劳对大鼠乳头体表达的影响．中国应用生理学杂志，2009，25(1):381-382．

［2］周郦楠，张晔，张晖.CGRP对多梗死大鼠海马CA4区NPY细胞影响的研究．中国实用医药，2010，5(18):13-14．

［3］包新民，舒斯云，曾建新.大鼠全脑缺血后纹状体边缘区内一氧化氮合酶、神经肽Y表达的变化．第一军医大学学报，2001，21(9):644-647．

［4］陈琳，高署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在脑缺血损伤中的作用．安徽医药，2004，8(1):3-6．

［5］Koh PO.Melatonin regulates nitric oxide synthase expression in ischemic brain injury．J Vet Med Sci，2008，70(7):747-750．

［6］童新，罗毅，张笑明，等.实验性大鼠脑缺血乳头体病理、神经降压素和生长抑素改变及机制研究．中风与神经疾病杂志，1992，9(4):193-195．