抗菌肽在养猪生产中的应用

丁 雪，刘显军

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）最早由瑞典科学家Boman等[1]用大肠杆菌诱导惜古比天蚕分离获得，是生物体免疫系统产生的分子质量较小，可以抵抗外界病原体侵害的，具有广谱杀菌活性的一类碱性多肽，也是生物体天然免疫系统的重要组成部分。抗菌肽是生物体为适应环境、求得生存而产生的免疫活性分子，具有选择性效应和无抗原性[2]。抗菌肽的作用机制与传统抗生素完全不同，不易产生耐药性，只对原核细胞和病变的真核细胞起作用，而对正常的真核细胞无影响。随着抗生素的限用，抗菌肽以其独特的杀菌机理作为新一代绿色抗微生物添加剂，在养猪生产上有着广泛的应用前景。

1 抗菌肽的理化特性及结构

大多数抗菌肽具有热稳定性，在100℃中加热10～15 min仍能保持活性。多数抗菌肽表现较强的阳离子特性，对较大的离子强度和较高或较低的pH，均具有较强的抗性。但也有文献报道，已发现了具有阴离子特性的抗菌肽类型，其作用机制与阳离子抗菌肽也不十分相同[3]。抗菌肽通常是由12～60个氨基酸组成，其N-末端富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等阳离子型氨基酸，其C-末端富含丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸，而中间部分则富含脯氨酸。因此，大多数抗菌肽都是阳离子型的，通常带有2～7个正电荷，等电点大于7[4]。另外，一些天然抗菌肽的C-末端往往呈酰胺化结构，这可能与其广谱抗菌的活性有关。它们的二级结构分4种类型，即β-折叠、两亲性α-螺旋、扩展片层和环状结构；三维构象可归纳为2种，即由疏水面和极性阳离子面相对而成的两性结构和由正电荷区支托疏水核心组成的翅状结构[5]。所有抗菌肽分子在二级结构上都有一个共同的特点，那就是其分子中的疏水部分与阳离子氨基酸部分分别位于分子结构的不同区域，形成了一个亲分子的结构，即与水和脂类物质都具有亲和力的结构，这也是抗菌肽发挥抗菌作用的基础[6]。

2 抗菌肽的分类及来源

抗菌肽来源十分广泛，从病毒、细菌、植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现[7]。目前已从动物、鸟类、植物与原核生物中分离到750多种抗菌肽。到目前为止，已经发现的抗菌肽有1 200多种。抗菌肽的分类方法有多种：根据氨基酸组成和结构特征可分为4类，即天蚕素、防御素、蛙皮素（富含脯氨酸）和蜂毒素（富含甘氨酸）；根据其作用对象的不同，抗菌肽可以分为抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽，既抗细菌又抗真菌的抗菌肽，既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等类型。根据其来源不同又可将抗菌肽分为哺乳动物抗菌肽、两栖类动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽和病毒抗菌肽等[8]。

3 抗菌肽的生物活性及作用机理

3.1 广谱抗菌活性及作用机理

抗菌肽具有广谱高效的抗菌活性[9-10]，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑制作用，还对真菌、原虫也有广泛的杀菌活性。如天蚕素在25～100 mg/L时对曲霉菌属和镰刀菌属的病原菌有杀灭作用[11]。并且它的抗菌浓度小，抗菌浓度单位一般在μmol/L水平。抗菌肽的种类不同，其抗菌活性和抗菌谱有着很大差异。如在抗菌肽天蚕素A、B和D中，天蚕素A、B对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（特别是革兰氏阴性菌）有较大的杀伤力，而天蚕素D只对大肠杆菌有高效的溶菌活性[12-13]。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽之间以及抗菌肽与传统抗生素之间具有协同作用，两者联用可提高抗菌肽和传统抗生素的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱。在抗菌肽的抗菌作用机制研究中，普遍认为抗菌肽分子可在细菌细胞质膜上穿孔形成离子通道，造成细菌细胞膜结构破坏,引起细胞内水溶物质渗出,最终导致细菌死亡[14-15]。

3.2 抗病毒作用及其机理

研究表明，抗菌肽有抗病毒活性[16]。抗菌肽的抗病毒功能，可影响从核酸复制到病毒颗粒包装的全过程。抗菌肽可通过与病毒外膜的直接结合发挥作用，例如，蛙皮素类抗菌肽和人的嗜中性粒细胞防御素（HNP-1）对疱疹病毒-HSV的抗病毒作用[17]。抗菌肽能抑制病毒的繁殖，如蜂毒素和天蚕素A在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖[18]。抗菌肽还可模仿病毒粒子干扰其组合。在蜂毒素对烟草花叶病毒TMV抑制作用的研究中，发现烟草花叶病毒衣壳蛋白的部分氨基酸序列和蜂毒素序列存在相似性，而这部分序列在病毒颗粒组装中与RNA和蛋白质结合密切相关。这样蜂毒素蛋白分子可以伪装成病毒包被蛋白，参与病毒合成，导致病毒颗粒无法正常组装[19]。

3.3 抗肿瘤活性

抗菌肽对肿瘤细胞有明显杀伤作用，而对正常细胞无害。这可能是因为真核细胞的质膜中含有丰富的膜蛋白和胆固醇，细胞中发达的微丝、微管与质膜结合，使得细胞膜比较稳定。正因为真核细胞有如此发达的细胞骨架，才不会被抗菌肽所溶解。但是，某些肿瘤细胞的细胞骨架系统不发达，抗菌肽可以插入癌细胞质膜，使双分子层发生融解，肿瘤细胞的完整性被破坏，细胞膜上形成的孔洞使内容物外泄，线粒体出现空泡化、嵴脱落、核膜破损、界限模糊不清、核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成[20-22]。天蚕素、爪蛙素等表现出对肿瘤细胞如纤维瘤细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞等的杀伤作用。

4 抗菌肽在养猪生产中的应用

4.1 抗菌肽在饲料添加剂中的应用

饲料中长期添加抗生素类促生长添加剂会产生耐药菌株、环境污染等严重后果。天然抗菌肽来源于动植物体，具有广谱抗菌作用，对畜禽具有抑菌促生长的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。动物体内的抗菌肽能抑制外源性病原菌的侵害，而对动物肠道存在的正常菌群和细胞无害。虽然肠源抗菌肽有选择性杀伤病原菌的优点，但其在动物体内的表达分泌量却十分有限，很难以对动物自身的保健起很大作用[23]。因此，研究开发抗菌肽作为饲料添加剂对促进畜禽生长、改善畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展具有重要意义。研究发现，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果较抗生素好，适量的抗菌肽比抗生素的促生长效果更理想。但高剂量的抗菌肽降低了仔猪的生长速度[24]。皮灿辉等（2008）研究认为，使用抗菌肽制剂6个月，能显著提高母猪的猪瘟抗体水平，对母猪的生产性能及免疫功能有改善作用[25]。李波等在母猪分娩前30 d到产后21 d添加400 mg/kg天蚕素抗菌肽，发现天蚕素抗菌肽能够提高母猪的繁殖性能和仔猪的生长性能等。综合各项指标，母猪产前30 d和产后21 d添加400 kg/mg的天蚕素抗菌肽的上述指标均高于添加抗生素的对照组，说明在这个生产阶段，天蚕素抗菌肽代替抗生素是可行的[26]。研究表明，在断奶仔猪日粮中添加抗菌肽，结果表明添加0.3%天蚕素抗菌肽能够提高断奶仔猪生产性能、促进肠道菌群平衡、改善血清生化指标、提高机体免疫力并减少应激，从而促进猪健康生长[27]。应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料，饲喂试验结果表明，柞蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪腹泻[28-29]。

4.2 抗菌肽的药用价值及其在猪病防治中的作用

仔猪腹泻、猪瘟、蓝耳病、猪瘟、圆环病毒2型感染、伪狂犬病及猪流感等疾病严重影响着养猪业的发展。长期广泛地使用抗生素，导致有效剂量不断加大，用药成本急剧上升。在剂量不断加大的同时，也增加了动物性食品抗生素的残留，严重威胁了人类的健康。抗菌肽作为替代抗生素的新型药物，在畜禽疾病防治中具有广阔的应用前景。汪以真等（2004）将抗菌肽与抗生素在体外对大肠杆菌K88、大肠杆菌ATCC25922、猪霍乱沙门氏菌ATCC500、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌ATCC25923的效果进行了研究，结果表明，抗生素抗金黄色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但对大肠杆菌的效果要差得多[30]。

5 抗菌肽的基因工程研究

抗菌肽天然产量很低，从生物体内分离抗菌肽不仅步骤繁琐，产率较低，而且合成抗菌肽的价格又相当昂贵。因此，利用基因工程技术来生产抗菌肽具有广阔的发展前景，它为抗菌肽的制备提供了新的途径。目前，多种抗菌肽已在不同的表达体系中得到表达。但如何进一步提高表达水平，提高基因表达产物的稳定性和广谱抗菌性，都是值得深入研究的问题。Yang等在2004年将人的阳离子抗菌肽hCAD-18/LL-37、凝血酶识别位点和硫氧还蛋白建构成表达载体pET-mh-CAD-18，然后在大肠杆菌中进行表达，获得的融合蛋白经凝血酶消化后形成重组的GSLL-39，重组的GSLL-39与其天然形式相比，在N末端多出2个氨基酸残基，但与其天然形式相似，具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性[31]。赖玉平等于2004年将从人汗腺中发现的抗菌肽DCD-1L基因克隆到毕赤酵母载体pPIC9中，并在毕赤酵母GS115中进行了表达。结果表明，GS115系统所表达的DCD-1L在pH 5.5～7.4范围内，具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性[32]。这些研究结果为基因工程获得的抗菌肽作为饲料添加剂或直接口服等应用的可能性提供了理论依据。

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