恶性胸腔积液来源的树突状细胞IFN-γ、IL-10的表达

闫廷赞，黄建安

(1.常州市第一人民医院呼吸内科，江苏常州213000;2.苏州大学附属第一医院呼吸内科，江苏苏州215000)

恶性胸腔积液是恶性肿瘤胸膜转移引起的，形成机制主要为胸膜通透性的增高和淋巴回流障碍。肺癌是最常见的病因，恶性胸腔积液的出现提示恶性肿瘤患者病程进展至晚期，预后差。但胸腔积液中含有丰富的免疫活性细胞，其有可能应用于肿瘤的免疫治疗。

树突状细胞(dendritic cell，DCs)是体内最有效的抗原递呈细胞，可以激活初始免疫应答，在机体免疫中有重要作用，近年成为肿瘤免疫治疗的热点［1］。本实验拟从恶性胸腔积液中分离DCs前体，体外诱导为DCs，通过检测其干扰素 － γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素－10(interleukin-10，IL-10)的表达，评估对淋巴细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 15例恶性胸腔积液标本选自我院收治的晚期肺癌患者，均经手术、纤维支气管镜等病理确诊，其中肺腺癌9例，鳞癌4例，小细胞癌2例。

1.2 DCs的诱导培养 常规胸腔穿刺获取恶性胸腔积液标本200～500 mL，加入肝素10 IU·mL－1抗凝，离心获取细胞沉渣，以Hanks液混悬细胞。在离心管中依次加入100%Ficoll、75%Ficoll(以含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640配制)及细胞悬液，使之形成3层具有2个清晰界面的液体，2 000 r·min－1离心30 min后，收集100%及75%Ficoll层间的细胞，洗涤后以含10%FCS的RPMI-1640调整细胞浓度为3～5×106mL－1，加入 6 孔板中(每孔 2 mL)，体积分数5%CO2、37℃培养箱中培养2 h后，轻轻吹打吸出悬浮细胞，贴壁细胞以 GM-CSF(100 mg·L－1)、IL-4(20 mg·L－1)、体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养6 d，再加入 TNF-α(20 mg·L－1)继续培养3 d。

1.3 DCs的表型分析 收集恶性胸腔积液培养6、9 d DCs孔中悬浮及半悬浮细胞，PBS洗涤后分至试管中，每管约2×105，分别加入PE标记的鼠抗人HLADR、CD83单克隆抗体各10 μL，FITC标记的鼠抗人CD1a单克隆抗体20 μL，并以相应标记的小鼠同型IgG抗体作对照，4℃冰箱中避光孵育30 min，PBS洗涤后流式细胞仪分析表型。

1.4 IL-10和IFN-γ含量的检测 收集恶性胸腔积液中培养6、9 d的 DC上清，按晶美生物工程公司ELISA试剂盒说明书分别检测IL-10和IFN-γ的含量。

1.5 主要试剂 胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640培养基 (美国Sigma公司)，人重组GM-CSF(厦门特宝生物工程公司)，人重组IL-4(北京医科大学免疫学 T细胞实验室)，人重组 TNF-α(美国 R＆D公司)，PE标记的鼠抗人CD83、HLA-DR及FITC标记的鼠抗人CD1a单克隆抗体(法国Immunotech公司);人IFN-γ ELISA试剂盒、人IL-10 ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)。

1.6 统计学处理 应用SPSS 11.0进行统计学分析。计量资料采用±s表示，比较采用配对t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 DCs形态的观察 培养2 d后倒置显微镜下观察，细胞聚集成小的集落，并有少量细胞悬浮，5～6 d后悬浮细胞明显增多，边缘形成明显毛刺状突起，培养8～9 d，可见细胞体积增大伸长，毛刺多而密，呈典型的DCs形态。

2.2 DCs表型 恶性胸腔积液中诱导培养9 d的DCs，高表达 MHCⅡ类分子 HLA-DR(93.4 ±3.1)%及人类DCs相对特异性分子CD83(53.8 ±11.3)%和CD1a(41.4 ±18.4)%，均明显高于诱导培养6 d的 DCs，分别为 HLA-DR(70.9 ±4.2)%、CD83(38.6±19.3)%、CD1a(24.9 ±11.1)%，比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 DCs培养上清中IL-10和IFN-γ含量 培养6 d的DCs上清中 IL-10和 IFN-γ含量分别为(649.9±316.7)ng·L－1和(21.6 ± 14.3)ng·L－1，TNF-α 刺激成熟后 IL-10 含量明显降低 (455.7 ±229.6)ng·L－1，IFN-γ含量则明显升高 (49.6 ±15.9)ng·L－1，比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

DCs因其成熟时有许多树突状突起而得名，未成熟期有较强的抗原吞噬和加工处理能力，但抗原递呈功能弱，接受抗原刺激后逐渐成熟，高表达共刺激分子和MHC分子，具有较强的抗原递呈功能，可刺激T淋巴细胞增殖，诱导免疫应答。本实验通过贴壁法分离恶性胸腔积液中DCs前体后，体外以GM-CSF、IL-4和TNF-α联合诱导培养，获得了典型树突状形态的DCs，TNF-α刺激后高表达MHCⅡ类分子HLA-DR，以及人类DCs相对特异性标志CD83和CD1a。CD83是DCs成熟的标志，MHC分子和共刺激分子在抗原递呈过程中分别提供第1信号和第2信号，是DCs识别、摄取抗原以及与其他免疫细胞间信号传递的必要条件，最能反映DCs的免疫功能。说明肺癌恶性胸腔积液中DCs前体可以体外诱导为正常形态、表型的成熟DCs，与钟华等［2］的研究结论是一致的。

恶性胸腔积液中淋巴细胞约占有核细胞的50%～70%，其中绝大部分为T淋巴细胞，B淋巴细胞较少。而其中又以CD4+T细胞为多，约占淋巴细胞数量的70%左右，CD8+T细胞次之。CD4+Th细胞根据其分泌的细胞因子的不同，可将其分为Th0、Th1和Th2细胞3种亚型。Th0细胞受不同的细胞因子刺激后，分别向Th1和Th2细胞分化。IL-2、IL-12和IFN-γ可促使Th0细胞向Th1细胞分化，Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ，与细胞毒性T淋巴细胞的增殖、分化、成熟有关，主要促进细胞免疫应答。而IL-4、IL-10等则促使Th0细胞向Th2细胞分化，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，与B淋巴细胞的增殖、成熟有关，因此Th2细胞主要增强体液免疫应答。

恶性胸腔积液中 IFN-γ、IL-12含量较低，而 IL-4水平相对较高［3］，说明恶性胸腔积液中的淋巴细胞Th1/Th2失衡，Th2占优势，Th2细胞主要和体液免疫有关，而抗肿瘤免疫是以细胞免疫为主，提示其中的淋巴细胞抗肿瘤活性是受到抑制的。而恶性肿瘤微环境中的DCs同样难以发挥有效的抗原递呈作用［4］。但恶性胸腔积液中的DCs前体在体外培养成熟后，具有较强的刺激同源肿瘤浸润淋巴细胞增殖的能力［5］。

Decker等［6］的研究证明正常人外周血来源 DCs具有TH1极性，而本文结果发现恶性胸腔积液中的DCs体外培养成熟后Th1型细胞因子IFN-γ分泌明显增高，Th2型细胞因子IL-10明显降低，也能促进Th1反应。因此，恶性胸腔积液来源的DCs不仅可以刺激淋巴细胞增殖，还可以通过细胞因子的分泌促进淋巴细胞分化，具有免疫治疗的潜能。

［1］Sabado RL，Bhardwaj N.Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment［J］.Immunotherapy，2010，2(1):37－56.

［2］钟华，韩宝惠，董强刚，等.肺癌胸腔积液中树突状细胞的诱导培养及功能分析［J］.中华结核和呼吸杂志，2004，27(8):542－545.

［3］Okamoto M，Hasegawa Y，Hara T，et al.T-helper type 1/T-helper type 2 balance in malignant pleural effusions compared to tuberculous pleural effusions［J］.Chest，2005，128(6):4030 － 4035.

［4］Ma Y，Aymeric L，Locher C，et al.The dendritic cell-tumor crosstalk in cancer［J］.Curr Opin Immunol，2011，23(1):146 －152.

［5］黄慧，曾波航，陈静琦.从恶性胸腔积液体外诱导成熟树突细胞［J］.癌症，2005，24(6):663 －666.

［6］Decker WK，Xing D，Li S，et al.Th-1 polarization is regulated by dendritic-cell comparison of MHC classⅠand classⅡantigens［J］.Blood，2009，113(18):4213 －4223.