环糊精葡萄糖基转移酶特性研究及来源菌株的筛选改造

杨颜慈

西北大学生命科学学院，陕西西安 710069

0 引言

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase）是一种水解酶，它既可以催化分子内部的也可以催化分子间的糖基转移反应，如环化、连接、不同葡萄糖数目的寡糖化[1]。CGTase 的主要功能是催化淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物合成环糊精（Cyclomaltodextrin ,CD）。根据环链的葡萄糖残基数目的不同，CD 可分为α-、β-、γ-环糊精等。由于环糊精在食品、化妆品、医药、环境保护、生物转换及纺织业等领域得到了广泛的应用，这使得催化环糊精形成的CGTases日益得到了人们的重视。

1 环糊精葡萄糖基转移酶的结构组成及其功能

除了来自克雷白氏杆菌的CGTases，其他的 CGTases 均有 5个可识别的域（A-E）[2]。A 域有 2 部分，A1 和 A2，分别位于氨基酸序列的第1-138和 203-406 位(来源于Bacillus circulans 251 的 CGT 酶)[2]。A 域包含 8 个 α-螺旋和 8 条平行的 β-折叠，具有催化性，因此也称为 (β/α)8桶状催化域[3]。B 域（139-202）是在 A 域的第三个β-折叠后面所延伸的一个环区域[2]。来自域 A/B 的+2 到-7 处的亚位点是催化位点[2]。Rimphanitcha- yakit 等[4]指出 C 域和 D 域对酶活性有强烈的影响作用，其功能可能是影响 E 域在酶上的正确定位。E 域则保证了 CGTase 的稳定性和完整性[5]。

2 环糊精糖基转移酶的产物专一性机理

人们研究认为各种CGT酶一级结构的不同引起了酶的产物特异性。通过分析α-、β-、γ-环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列，发现前两种酶的一级结构很相近，但γ型则与前两种类型的酶在以及结构中有较大的差异[6]。Rimphanitchayakit等[4]的实验结果指出，对酶产物专一性有重要影响的氨基酸区域从碳端算起在功能域A和B区域的中部。Boris等[7]研究认为亚位点6,7,8是酶特异性的关键位点，对这些亚位点的氨基酸序列进行突变实验，会引起酶产物专一性的变化。

3 环糊精葡萄糖基转移酶的催化反应类型

环糊精葡萄糖基转移酶能催化淀粉和其他相关的碳水化合物经分子内的糖基转移作用环化合成环糊精，即环化反应；该酶还能通过分子间的糖基转移作用催化偶合反应和歧化反应；再者，环糊精葡萄糖基转移酶还具有较弱的催化淀粉水解的能力，即水解反应。

环化作用是CGTase的特有反应，α-（1-4）葡聚糖分子通过分子内糖基转移反应生成CD。该反应受SDS、Triton等界面活性剂影响，所生成的CD种类，要由界面活性剂的疏水性基的大小而定[8]。表面活性剂对α-CGT酶生产的促进作用可能是由大肠杆菌细胞内外膜渗透性增加所致，使细胞周质空间中α-CGT酶能更加快速地渗透到胞外[9]。

4 影响环糊精葡萄糖基转移酶特性及产物的一些因素

不同来源的CGTase 会有不同的反应活性、最适反应条件及主要产物，但一些酶的最适反应条件范围较窄且具有不稳定性或其主要产物不是人们需求的，所以人们希望通过对酶的一些修饰改造达到扩大最适反应条件范围，增加酶活力、稳定性及目标产物量的目的。

4.1 不同化学修饰对酶活性的影响

曹新志等[10]用焦碳酸二乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺和碳化二亚胺修饰后，酶活力大幅度下降，说明组氨酸、色氨酸和羧基氨基酸为酶活力所必需。

4.2 氨基酸残基突变对酶热稳定性的影响

傅毅等[11]研究发现氨基酸残基经过突变后含有了更多的带电残基，突变型的酶中盐桥数量增加了10%。氨基酸残基的突变使蛋白质的总能量降低，外周的离子键和疏水性增强，使得酶的耐热性增加。

4.3 一些化学物质对酶稳定性的影响

郑贤良等[12]筛选出了可以提高重组 α-CGT 酶热稳定性及贮存稳定性的四种稳定剂：明胶、甘油、PEG400、CaCl2。将上述4种稳定剂按一定浓度组合成复合稳定剂，其稳定效果可明显提升。

5 产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株的筛选及改造

可作为CGTase生产者的大多数微生物来自杆菌类；厌氧分支杆菌、克雷白氏杆菌、超嗜热古菌、嗜热产气杆菌及嗜高温菌也是该酶的来源菌种[2]。

5.1 产α-环糊精为主的菌株

Gawande等[13]发现了一种可以产CGTase的菌株——Klebsiella pneumoniae AS-22。此菌株产的CGTase的最适反应温度为35℃～50℃，最适pH为6～9。当以糊化淀粉和小麦淀粉为底物时，该酶的产物包括α-环糊精、β-环糊精及γ-环糊精，其比例是81:12:7。

5.2 产β-环糊精为主的菌株

王雁萍等[14]采用氯离子注入法对一株被鉴定为嗜碱芽孢杆菌的菌株进行诱变，得到了产β-环糊精葡萄糖基转移酶的高产菌株，其酶活力达到6 000U/mL。该菌株产生目标酶的最适温度为28℃，pH为9。

5.3 产γ-环糊精为主的菌株

嗜碱的Bacillus sp.290-3、Bacillus sp.AL-6和类芽孢杆菌Brevibacterium sp.No.9605是到目前为止仅有产生γ-CD CGTase的菌株[15]。

5.4 将产酶基因转入常见菌种进行生产

成成等[16]将来源于软化类芽孢杆菌的α-CGTase 基因插入质粒，并将构建的表达载体转化表达宿主大肠杆菌，得到重组菌E. coli BL21/ pET-cgt。该方法得到的α-CGTase的胞外比活比来源菌所产天然酶的比活提高了42倍。

6 展望

人们对CGTase的研究已有百年历史，特别是近二十年,环糊精利用范围的增加使 CGTase的研究成为了热点，人们对这类酶的结构、催化机理及一些来源菌株已经有了较深的认识，但也有许多问题人们还未研究清楚，如CGTase产物专一性的机理，结构域D的功能等。相信随着科学技术手段的发展及人们对菌株改造手段的提升, CGTase的结构与功能将会明晰,其产物的专一性机理及增大生产实践中单一产物的生产量问题也会得到解决，对该酶的透彻研究必将促进其在各方面的应用，为人类带来巨大效益。

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